[發明專利]一種達氏鱘性腺差異表達基因GSDF及其篩選方法

在審

• 申請號: 201711262439.1
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN107937394A
• 公開（公告）日: 2018-04-20
• 發明（設計）人: 陳葉雨;劉亞;龍治海;林玨;龔全;賴見生;杜軍;宋明江
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院水產研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司11246
• 代理人: 夏艷

1.一種達氏鱘性腺差異表達基因GSDF，其特征在于，所述基因序列具有SEQ ID No.1中的核苷酸序列。

2.權利要求1所述的達氏鱘性腺差異表達基因GSDF在達氏鱘性別鑒定、性別決定基因及性別決定機制中的應用。

3.一種權利要求1所述的達氏鱘性腺差異表達基因GSDF的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)達氏鱘cDNA文庫的構建：用TRIzol試劑盒提取達氏鱘組織RNA，構建達氏鱘轉錄組文庫；

(2)測序數據質量控制：高通量測序得到的原始圖像數據經Illumina Casava堿基識別軟件分析轉化為原始測序序列，隨后對Raw data進行數據過濾，去除其中的接頭序列及低質量Reads獲得高質量的Clean data；

(3)組裝：原始測序序列經過濾處理得到高質量測序序列，采用Trinity軟件對clean reads進行拼接得到轉錄本序列，取每條基因中最長的轉錄本作為unigene；

(4)功能注釋：使用BLAST軟件將Unigene序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG數據庫比對，使用KOBAS2.0得到Unigene在KEGG中的KEGG Orthology結果，預測完Unigene的氨基酸序列之后使用HMMER軟件與Pfam數據庫比對，獲得Unigene的注釋信息；

(5)差異基因的篩選：使用EBSeq進行差異表達分析，獲得兩個樣品之間的差異表達基因集；在差異表達分析過程中采用Benjamini-Hochberg方法對原有假設檢驗得到的顯著性p值進行校正，并最終采用校正后的p值，即錯誤發現率作為差異表達基因篩選的關鍵指標，將FDR小于0.05且差異倍數倍性變化大于等于2作為篩選標準；

(6)差異基因的功能注釋：基于基因在不同樣品中的表達量，對識別到的差異表達基因進行功能注釋，分別與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG數據庫比對，獲得上調或下調表達基因的注釋信息；

(7)性別決定相關基因的篩選：利用其余物種中已知與性別決定相關基因的序列在差異基因中進行篩選，最終得到達氏鱘雌雄性腺差異表達基因，所述基因序列具有SEQ ID NO.1中的核苷酸序列；

(8)實時定量PCR驗證：對于所得具有SEQ ID NO.1中的核苷酸序列的差異表達基因進行實時定量PCR的驗證。

4.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟(8)中的實時定量PCR反應體系為：上游引物F和下游引物R各0.5μL，待測達氏鱘樣品模板1.0μL；RNase Free Water 8.0μL。

5.根據權利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述上游引物F和下游引物R序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

6.根據權利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述步驟(8)中的實時定量PCR反應條件如下：95℃預變性5min；95℃變性20s，55℃退火20s，72℃延伸20s，70～95℃采集信號，40個循環。