[發(fā)明專利]用于檢測水稻抗褐飛虱Bph3基因的SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711262413.7
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN107868842B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭佩;江南;鄭秀婷;梁毅;賀治洲
• 申請（專利權(quán)）人: 華智水稻生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發(fā)明提供用于檢測水稻抗褐飛虱基因Bph3的SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明公開了與水稻抗褐飛虱基因Bph3共分離及擴(kuò)增效果良好的SNP標(biāo)記K_040503，該標(biāo)記檢測水稻第4號染色體6903106位堿基，多態(tài)性為C/G?；贙ASP技術(shù)開發(fā)的標(biāo)記K_040503引物序列如SEQ ID No.1?3所示。本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記檢測Bph3基因位點為高特異性的位點，可便捷高效的用于鑒定水稻品種中是否含有Bph3基因。本發(fā)明提供的SNP分子標(biāo)記的應(yīng)用方法準(zhǔn)確可靠，操作簡便，適用于Bph3基因的鑒定及輔助選擇育種。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及水稻抗褐飛虱基因Bph3的SNP分子標(biāo)記以及檢測該分子標(biāo)記的方法。

背景技術(shù)

水稻是我國的重要糧食作物。褐飛虱是一種水稻單食性害蟲，通過口針吸食韌皮部汁液為害稻株，造成水稻生長緩慢、分蘗延遲、空癟粒增加。褐飛虱還是草狀叢矮病毒和齒葉矮縮病毒等一些水稻病毒的傳播媒介，嚴(yán)重影響水稻的生產(chǎn)和安全。目前，對褐飛虱的防治主要依賴于化學(xué)防治，不但增加了生產(chǎn)成本和害蟲的耐藥性，而且污染環(huán)境，因此，利用寄主抗性培育抗褐飛虱品種被認(rèn)為是防治其危害的有效途徑。

到目前為止，已經(jīng)鑒定和報道了至少34個抗褐飛虱基因位點，其中顯性基因19個，隱性基因15個，已經(jīng)定位的主效抗褐飛虱基因達(dá)28個，有4個抗性基因被克隆，分別是Bph3(Liu et al.2014)、Bph14(Du et al.2009)、Bph9(Zhao et al.2016)和Bph26(Ji etal.2016)。Liu等從斯里蘭卡當(dāng)?shù)囟i稻品種Rathu heenati中克隆了顯性基因Bph3，該基因是一個由3個編碼質(zhì)膜凝集素受體激酶(OsLecRK1-OsLecRK3)組成的基因簇，同時抗生物型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，是目前為止抗性最廣的抗褐飛虱基因(王慧，2016；國家水稻數(shù)據(jù)中心)。

由于抗蟲表型鑒定過程繁瑣復(fù)雜，限制了水稻抗褐飛虱品種的育種效率，且利用常規(guī)育種手段往往難以有效地聚合不同的抗蟲基因。開發(fā)與抗蟲基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assisted selection，MAS)技術(shù)聚合一個或多個目的基因或QTL，從而選育持久抗性品種，延緩抗蟲品種的退化年限和防止褐飛虱新生物型的發(fā)生。

傳統(tǒng)的水稻抗蟲育種是通過抗性鑒定對植株進(jìn)行表型選擇，耗費時間長，且易受環(huán)境條件的限制，鑒定結(jié)果容易造成誤差，選擇效率較低。利用分子標(biāo)記輔助選擇育種簡單有效，可以降低育種成本，縮短選育周期，亦可進(jìn)行有目的的多基因聚合，提高育種效率，帶來巨大的社會經(jīng)濟(jì)效益。文獻(xiàn)報道中主要利用的標(biāo)記類型為SSR和InDel標(biāo)記，在育種中存在多態(tài)率較低，差異較小的缺點。檢測過程中使用的EB或聚炳烯酰胺易對環(huán)境造成污染、對人體產(chǎn)生危害。開發(fā)與抗褐飛虱基因Bph3共分離的特異性分子標(biāo)記及建立高效、環(huán)境友好的相關(guān)檢測體系，則對促進(jìn)Bph3基因在商業(yè)化育種中的應(yīng)用具有重要意義?；贙ASP的基因分型方法是通過計算機(jī)記錄并分析PCR過程中產(chǎn)生的熒光信號，實現(xiàn)對突變位點監(jiān)測。檢測結(jié)果與表現(xiàn)型一致性高；檢測過程無需電泳，徹底杜絕了PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染和EB對環(huán)境的污染、甲醛對人體的危害。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測水稻抗褐飛虱基因Bph3的SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：根據(jù)基因的定位信息，抗褐飛虱基因Bph3位于水稻4號染色體6939046-6969039區(qū)間，以基因區(qū)間為中心向兩側(cè)各擴(kuò)大50kb提取SNP位點，并根據(jù)PIC值及SNP位點周邊50bp是否有其他SNP位點等進(jìn)行挑選。同時，根據(jù)已經(jīng)克隆的Bph3基因序列與日本晴序列進(jìn)行比對，挑選出的SNP位點，利用BatchPrimer3對其進(jìn)行引物設(shè)計。針對這些SNP標(biāo)記，對含有Bph3基因供體材料RH、IR56和其它不含Bph3的多個水稻品種進(jìn)行KASP反應(yīng)驗證，挑選出能特異性區(qū)分抗性供體材料并擴(kuò)增效果好的SNP標(biāo)記K_040503。通過95份自然群體材料對所挑選的抗性基因連鎖SNP標(biāo)記K_040503進(jìn)行自然群體驗證，表明抗性堿基為稀有堿基。