[發明專利]一種擬穴青蟹產地的鑒別方法

在審

• 申請號: 201711259705.5
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN108333206A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 葉央芳;李榮華;裴峰;李永亮;母昌考;王春琳
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 張一平;葉桂萍

1.一種擬穴青蟹產地的鑒別方法，其特征在于：所述方法是先選擇若干個不同產地的擬穴青蟹，對擬穴青蟹肌肉的水相提取物中的小分子代謝物組成進行分析，然后采用OPLS-DA對¹H NMR數據進行多變量統計分析，建立OPLS-DA模型獲得不同產地的擬穴青蟹的特征性代謝物；當需要檢測某一來自上述產地的未知擬穴青蟹時，能夠采用方案A或者方案B獲知其產地信息：

其中方案A具體是：先對這一未知擬穴青蟹的水相提取物中的小分子代謝物的種類進行檢測并計算相對含量，然后將數據導入OPLS-DA模型中，即可獲得這一未知擬穴青蟹的產地信息；

方案B具體是：檢測一個以上的特征性代謝物在這一未知擬穴青蟹中的存在情況，根據特征性代謝物的存在情況獲知產地信息。

2.根據權利要求1所述的擬穴青蟹產地的鑒別方法，其特征在于建立所述OPLS-DA模型以獲得不同產地的擬穴青蟹的特征性代謝物，具體是將OPLS-DA模型中一維¹H-NMR的權重值|r|大于0.666的主成分進行ANOVA檢驗，結合P值判斷差異表達代謝物，p<0.05為差異有統計學意義，獲得若干個差異代謝物。

3.根據權利要求1所述的擬穴青蟹產地的鑒別方法，其特征在于所述產地是慈溪、三門、霞浦和欽州。

4.根據權利要求1～3任意一項權利要求所述的鑒別方法，其特征在于：所述鑒別方法包括如下步驟：

(1)待檢測擬穴青蟹的預處理

將分別獲取不同產地的待檢測擬穴青蟹樣品，清洗后，獲取不同產地的擬穴青蟹游泳足的肌肉；

(2)破碎

分別稱取不同產地的待檢測擬穴青蟹肌肉樣品加入冷甲醇水溶液進行細胞破碎；

(3)離心

離心具體步驟為：將步驟(2)破碎后的肌肉樣品在10000r/min-15000r/min、0-4℃下離心，抽取上清液，殘渣中再加入冷甲醇水溶液，振蕩混勻，重復上述操作3～4次，合并上清液；

(4)真空揮發

將步驟(3)的上清液放入離心管中，真空下揮發甲醇；

(5)真空冷凍干燥

將步驟(4)中揮發甲醇后的肌肉提取液，先放入-20℃～的冰箱內冷凍12h，再冷凍干燥過夜，獲得凍干粉。

(6)核磁譜采集

取上述真空冷凍干燥的樣品加入磷酸緩沖溶液進行離心得到上清液，上清液在核磁共振儀為600MHz以上的核磁共振波譜儀進行擬穴青蟹肌肉小分子代謝物的檢測，得到一維¹H-NMR譜數據；

所述核磁共振技術鑒定參數如下：使用標準的Noesypr1D脈沖序列RD-90°-t₁-90°-t_m-90°-ACQ采集一維¹H NMR譜，在該序列中的等待時間RD為25s和混合時間t_m為100ms施加強度約50Hz的低功率連續波進行水峰抑制，每一個樣品的90°脈沖寬度均設置約10s，譜寬設置為20ppm，采樣點數32，768，FID累加32次；

所述的擬穴青蟹特征小分子代謝物是延胡索酸、谷氨酰胺、三甲胺氧化物、2-吡啶甲醇、腺苷單磷酸、谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、肌苷單磷酸和丙氨酸；

(7)數據分析

對待鑒定的樣品的所有一維¹H-NMR譜數據經傅立葉變換得到譜圖，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二維NMR譜對區分不同產地有顯著貢獻的代謝物進行了歸屬。以內標物(TSP，0ppm)對所有一維¹H NMR進行化學位移定標，調整相位并校正基線之后，對NMR譜(0.80-9.50ppm)進行分段積分，積分區間為2.4Hz；去除殘存的水信號(4.70-5.15ppm)和甲醇信號(3.35-3.38ppm)所在的積分區間之后，對整個譜進行重量歸一化。采用SIMCA-P⁺軟件對歸一化的NMR數據進行OPLS-DA分析，該分析中選用了自動規格化的數據處理模式，并以該自動規格化的NMR數據作為X變量，而分組信息作為Y變量，采用7倍交叉驗證和進一步的交叉驗證的方差分析來確保OPLS-DA模型的可靠性，R²和Q²值可分別指示模型的可預測能力和質量，而CV-ANOVA的分析結果也同時符合p<0.05時，模型才可靠；在對自動規格化的NMR數據作進一步的回溯轉換處理后，再利用MATLAB軟件可獲得OPLS-DA模型的載荷圖；載荷圖上的每一個點用顏色來表征，不同顏色對應于自動規格化的權重值，權重即表示回溯轉換處理后的變量(X)和分組變量(Y)之間的皮爾森積差相關系數(r)；采用相關系數的絕對值(|r|)，只有當|r|大于0.666時，其相應的代謝物才對組間區分具有顯著性貢獻(n＝8，p<0.05)；

(8)樣品鑒別

若待檢測擬穴青蟹的樣品中含有最高水平的丙氨酸和延胡索酸，含有最低水平的腺苷單磷酸和、2-吡啶甲醇，則該樣品為慈溪產地的擬穴青蟹；

若待檢測擬穴青蟹的樣品中含有最高水平的谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸，則該樣品為三門產地的擬穴青蟹；

若待檢測擬穴青蟹的樣品中含有最高水平的2-吡啶甲醇，但含有最低水平的丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和苯丙氨酸，則該樣品為霞浦產地的擬穴青蟹；

若待檢測擬穴青蟹的樣品中含有最高水平的腺苷單磷酸，但含有最低水平的肌苷單磷酸，則該樣品為欽州產地的擬穴青蟹。