[發(fā)明專利]一種基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法及系統(tǒng)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711257675.4
• 申請(qǐng)日: 2017-12-04
• 公開（公告）號(hào): CN107904296A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾興;劉顯君;王康;邸宏;王振華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869
• 代理公司: 成都環(huán)泰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)51242
• 代理人: 鄒翠,李斌

1.一種基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，所述基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法包括：

用雙標(biāo)簽融合引物對(duì)做PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因耐鹽堿玉米種植區(qū)土壤樣品中提取的微生物宏基因組DNA中的16S rDNA V4區(qū)，構(gòu)建文庫(kù)；

對(duì)合格文庫(kù)進(jìn)行深度測(cè)序，得到純凈READS；

拼接成TAG，土壤樣品產(chǎn)出至少5.0萬條有效TAG用于聚類成可操作分類單元OTU。

2.如權(quán)利要求1所述的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，所述引物對(duì)，其中一含P5Illumina接頭序列、8核苷酸的標(biāo)簽以及特異性引物515F，515F的核苷酸序列是SEQ ID NO.1；

另一引物含P7Illumina接頭序列、8核苷酸的標(biāo)簽以及特異性引物806R，806R的核苷酸序列是SEQ ID NO.2。

3.如權(quán)利要求1所述的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，對(duì)合格的文庫(kù)用IlluminaHiseq PE250進(jìn)行深度測(cè)序，并對(duì)讀取序列READS進(jìn)行質(zhì)量控制:

剔除含有Primer/Adaptor的READS；

剔除含有過多non-ATCG堿基N的READS；

剔除測(cè)序質(zhì)量較低的堿基數(shù)占的比例過高的READS。

4.如權(quán)利要求1所述的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，

把純凈的成對(duì)READS拼接成TAG，然后聚類成可操作分類學(xué)單元OTU后，再做物種組成、結(jié)構(gòu)、多樣性及相對(duì)豐度差異的顯著性分析；

根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù)，進(jìn)行稀有頻率數(shù)據(jù)的多重假設(shè)檢驗(yàn)和假發(fā)現(xiàn)率FDR分析，評(píng)估豐度差異的顯著性。

5.如權(quán)利要求4所述的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，做物種組成、結(jié)構(gòu)、多樣性及相對(duì)豐度差異的顯著性分析后，還進(jìn)行：

確定根際土壤原核微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、多樣性、相對(duì)豐度，利用方差分析比較不同玉米取樣時(shí)期上述指標(biāo)之間的異同。

6.如權(quán)利要求1所述的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，用雙標(biāo)簽融合引物對(duì)做PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因耐鹽堿玉米種植區(qū)土壤樣品中提取的微生物宏基因組DNA中，宏基因組DNA用PowerSoil DNA Isolation Kit提取，其中，土壤樣品的均質(zhì)化在渦旋混合器上以轉(zhuǎn)速3000rpm運(yùn)轉(zhuǎn)15分鐘。

7.如權(quán)利要求1所述的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，所述的深度測(cè)序在Illumina Miseq平臺(tái)上，以PE250模式做16S rDNA的V4高變區(qū)片段高通量測(cè)序。

8.如權(quán)利要求1所述的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法，其特征在于，用雙標(biāo)簽融合引物對(duì)做PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因耐鹽堿玉米種植區(qū)土壤樣品中提取的微生物宏基因組DNA中的16S rDNA V4區(qū)，之前需進(jìn)行：

將轉(zhuǎn)基因耐鹽堿玉米種植于大田試驗(yàn)地三個(gè)或三個(gè)以上小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積不小于20m²，每個(gè)小區(qū)有至少3個(gè)取樣點(diǎn)，每個(gè)取樣點(diǎn)取至少3棵轉(zhuǎn)基因耐鹽堿玉米植株；

先除去地面雜草和枯枝落葉，鏟除大田土壤表面1cm-2cm的表土，然后將苗期、拔節(jié)期、抽絲散粉期、成熟期的玉米植株連根從土中取出，用抖落法去除根系抖落土，將細(xì)根放入裝有25mlPBS液的50mL離心管中，利用渦旋震蕩將根際土從根上分離，混合均勻，并于-80℃保存。

9.一種如權(quán)利要求1所述基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的方法的基于深度測(cè)序檢測(cè)玉米根際土壤微生物的系統(tǒng)。