[發明專利]抗八種三嗪類農藥的群選性單克隆抗體制備及其應用

有效

• 申請號: 201711256952.X
• 申請日: 2017-12-04
• 公開（公告）號: CN109868261B
• 公開（公告）日: 2020-11-27
• 發明（設計）人: 楊美華;劉聰敏;豆小文
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;C07K14/77;C07D251/52;C12R1/91
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 馬小星

本發明公開了一種抗八種三嗪類農藥的群選性單克隆抗體制備方法和應用，屬于生物技術領域。本發明通過在1，3，5?三嗪環上引入合適的活性手臂，制備免疫半抗原和包被半抗原，活性酯法分別偶聯雞卵白蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)制備免疫原和包被原，用免疫原免疫Balb/c鼠，通過雜交瘤技術制備單克隆抗體，基于該抗體，以包被原作為檢測抗原，建立了異源的間接競爭酶聯免疫分析方法(ELISA)，可用于檢測包括撲草凈、撲滅通、疊氮津、仲丁通、莠去通、敵草凈、西草凈、莠滅凈在內的八種三嗪類農藥，該方法的檢測成本低，靈敏度高，操作簡便，適用于該八種三嗪類農藥的現場快速大量篩查。

技術領域

本發明涉及抗八種三嗪類農藥的群選性單克隆抗體的制備方法及其在酶聯免疫分析方法中的應用，適用于包括撲草凈、撲滅通、疊氮津、仲丁通、莠去通、敵草凈、西草凈、莠滅凈在內的八種三嗪類農藥的現場快速篩查，屬于農藥殘留快速檢測領域。

背景技術

我國農業生產持續、穩定增長，與此同時，化肥、化學農藥、除草劑等農用化學品的長期、大量、不合理使用，對我國農業生態環境和農畜產品的安全生產及人體健康與生命構成了嚴重威脅，由農藥殘留引起人畜中毒死亡事件頻繁發生。我國蔬菜、茶葉出口中每年因農藥殘留超標而被進口國拒收、扣留、索賠、終止合同、拒絕入關等事件時有發生，給國家帶來巨大的經濟損失并丟失了國際市場，有損國家形象。

三嗪類農藥是一類傳統的高選擇性除草劑，早在上世紀50年代便開始在世界范圍內登記使用，年銷售額過億。其主要通過抑制光合作用而控制雜草的生長，被廣泛用于農業生產過程的化學除草。然而，該類除草劑有類似苯環的結構，化學性質穩定，半衰期長，不易降解，能長期存在并富集于被施用對象中，造成環境、土壤和農產品污染，對人類健康造成嚴重威脅，如損傷人體免疫、如損害人體免疫、干擾內分泌系統、引發癌癥及先天性缺陷等。

傳統的檢測三嗪類農藥的方法有液相色譜法、液質聯用法等，雖然以上方法準確、靈敏度高，但需要的儀器設備昂貴，并且操作復雜，對操作人員的要求較高，且限于專業實驗室內使用。近年來，酶聯免疫分析方法(ELISA)因其特異性強、靈敏度高、操作簡便、低成本且適用于現場大批量樣品快速檢測的特點，逐漸成為農藥殘留快速檢測的熱點。

雖然三嗪類農藥抗體及相關免疫分析方法已有報道，但多數圍繞莠去津及其他氯代的三嗪類農藥進行研究，對硫代和氧代的三嗪農藥研究較少，針對撲草凈、撲滅通、疊氮津、仲丁通、莠去通、敵草凈、西草凈、莠滅凈的群選性單克隆抗體及酶聯免疫分析方法尚未見報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種可用于八種三嗪類農藥(撲草凈、撲滅通、疊氮津、仲丁通、莠去通、敵草凈、西草凈、莠滅凈)檢測的群選性單克隆抗體，以及建立一種簡單且具高靈敏度的檢測三嗪類農藥的異源間接競爭ELISA方法，該方法可用于環境及農產品中三嗪類農藥殘留的靈敏快速檢測。其優點在于不需要昂貴的大型分析儀器，使用簡便，通過閱讀說明書，非專業人員即可進行操作，并且檢測快速，大大增加了三嗪類農藥檢測的篩查效率和普及程度，具有廣闊的開發前景。

本發明獲得了能夠產生特異性識別八種三嗪類農藥的群選性單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細胞株TZ5E4，此細胞株已于2017年11月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號：CGMCCNo.14732；此外，本發明通過合成包被抗原，建立了異源的間接競爭ELISA方法，是一種針對該八種三嗪類農藥的高靈敏度及高通量的檢測系統。

技術方案：

1.抗八種三嗪類農藥的雜交瘤細胞株，保藏編號為CGMCC No.14732。

2.抗八種三嗪類農藥的群選性單克隆抗體，有保藏號為CGMCC No.14732的雜交瘤細胞株所分泌，所述單克隆抗體命名為TZ5E4。

3.本發明所述的抗八種三嗪類農藥的群選性單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：