[發明專利]人亨廷頓基因敲入用重組載體及其構建方法和在模型豬構建中的應用

有效

• 申請號: 201711251907.5
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN107988256B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 閆森;李曉江;賴良學;李世華
• 申請（專利權）人: 暨南大學;中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/877;A01K67/027
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 林青中;萬志香

1.一種重組載體的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：構建含有人突變的亨廷頓基因片段的敲入片段，所述人突變的亨廷頓基因片段為含人亨廷頓基因第一外顯子中CAG重復序列突變的序列片段，且在該敲入片段中，所述人突變的亨廷頓基因片段的上游和下游分別連接有與小型豬的亨廷頓基因同源的同源臂，將所述敲入片段連接至載體上，得到所述重組載體；

所述將所述敲入片段連接至載體上還包括如下步驟：以序列如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示的DNA片段為上、下游引物，以小型豬的基因組DNA為模板擴增得到小型豬的兩條同源臂以及位于該兩條同源臂中間的豬亨廷頓基因第一外顯子片段，將該擴增產物經EcoRI和KpnI酶切后連接至經同樣內切酶切割制得的pBluescript KS(-)載體上，形成pBS-HD質粒，然后將所述人突變的亨廷頓基因片段插入該兩條同源臂的中間替換豬亨廷頓基因第一外顯子片段，得到pBS-HD-KI重組載體。

2.如權利要求1所述的重組載體的構建方法，其特征在于，所述人突變的亨廷頓基因片段中的CAG重復序列的數量超過36個。

3.如權利要求2所述的重組載體的構建方法，其特征在于，所述人突變的亨廷頓基因片段中的CAG重復序列的數量為150個。

4.如權利要求2所述的重組載體的構建方法，其特征在于，所述人突變的亨廷頓基因片段的序列如SEQ ID No.13所示。

5.如權利要求4所述的重組載體的構建方法，其特征在于，所述將所述人突變的亨廷頓基因片段插入該兩條同源臂的中間替換豬亨廷頓基因第一外顯子片段包括如下步驟：

以人突變的亨廷頓基因片段為模版，并在其兩端設計NcoI和ApaI酶切位點，PCR擴增出連接有酶切位點的人突變的亨廷頓基因片段；

將pBS-HD質粒與接有酶切位點的人突變的亨廷頓基因片段分別進行NcoI和ApaI雙酶切；

利用T4 DNA連接酶將人突變的亨廷頓基因片段連接至pBS-HD質粒中，得到所述pBS-HD-KI重組載體。

6.一種人亨廷頓基因敲入模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：針對小型豬的亨廷頓基因的第一外顯子后的內含子序列滿足G(N)₁₆NGG序列模式的正鏈序列部分分別設計兩個序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的sgRNA的識別序列，分別記為第一sgRNA識別序列和第二sgRNA識別序列，所述第一sgRNA識別序列和所述第二sgRNA識別序列均與相應內含子正鏈序列G(N)₁₆一致，N為A、T、C或G，下標16表示N的個數；

步驟二：分別對所述第一sgRNA識別序列和第二sgRNA識別序列設計互補序列，所述第一sgRNA識別序列及其互補序列構成第一雙鏈DNA，所述第二sgRNA識別序列及其互補序列構成第二雙鏈DNA；

步驟三：分別根據所述第一雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA設計sgRNA轉錄載體，記為第一sgRNA載體和第二sgRNA載體，其中，所述第一sgRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所述第二sgRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA；

步驟四：將第一sgRNA載體、第二sgRNA載體、供體載體以及含有Cas9切口酶基因的載體共轉染小型豬的成纖維細胞，篩選出人亨廷頓基因敲入的陽性單細胞克隆，所述供體載體采用如權利要求1～5中任一項所述的重組載體的構建方法構建得到；

步驟五：將所述陽性單細胞克隆消化成單個細胞，注射入小型豬的去核卵母細胞中，形成重構卵。

7.如權利要求6所述的人亨廷頓基因敲入模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，在所述步驟三中，所述第一sgRNA載體和第二sgRNA載體均為U6啟動子啟動的轉錄載體。

8.如權利要求6～7中任一項所述的人亨廷頓基因敲入模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，在所述步驟四中，所述共轉染是使用電轉染的方法，電轉染的參數：1400V、10ms、1pulse。