[發明專利]一種基于液相色譜檢測動物體中小分子代謝物的方法

在審

• 申請號: 201711249721.6
• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN107782825A
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 羅杰;唐堂
• 申請（專利權）人: 武漢邁特維爾生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 汕頭市南粵專利商標事務所(特殊普通合伙)44301
• 代理人: 余飛峰

技術領域

本發明涉及代謝組學技術領域，尤其涉及一種基于液相色譜檢測動物體中小分子代謝物的方法。

背景技術

在生命體中，代謝物是生物體整個生命活動的最終產物，處于生化活動調節的末端，因此代謝物既可以反映機體的生理和病態狀態，又能反映外界環境刺激對機體的影響。

代謝組學是通過利用化學分析技術和計量方法研究生物體受刺激或擾動前后生物內源小分子代謝產物的動態變化規律，并確定這些變化與生物過程相關性的一門學科，它是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學后系統生物學的另一重要研究領域，已逐漸成為整體性研究生命系功能變化的重要手段之一。

生物體中代謝物的組成十分復雜，并且各成分含量差異大，許多痕量代謝物有重要的生理功能和意義，因此如何對生物樣品進行全面的、無差別的、高通量和高靈敏度的定性定量分析，仍是目前代謝組學發展的瓶頸所在，雖然申請號為201010562426.8的中國發明專利公開了一種利用LC-MS/MS高效鑒別植物次生代謝產物的方法，但該發明僅提出了對植物不同組織的次生代謝產物進行高通量、高靈敏度鑒別的技術方案，而如何對動物體中小分子代謝物進行高通量、高靈敏度的檢測，現有技術仍存在空缺。

發明內容

本發明的目的在于針對已有的技術現狀，提供一種基于液相色譜檢測動物體中小分子代謝物的方法。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種基于液相色譜檢測動物體中小分子代謝物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1：人體樣品制備

步驟1.1：血漿樣品制備：取出凍存的血漿樣本，解凍后取一定量的血漿于EP管中，按體積比例加入冰甲醇，經過渦旋和離心后取上清液于新的EP管中，冷凍保存；

步驟1.2：組織樣品制備：取出凍存的組織樣本，將組織切碎，混勻后稱量一定量的組織裝入EP管中，按照重量比例加入提取液，依次經過勻漿、冰水浴和離心后，取上清液于新的EP管中，冷凍保存；

步驟1.3：分別取等量的血漿樣品和組織樣品，混合均勻后裝入進樣瓶中，上機待測；

步驟2：建立基礎數據庫

步驟2.1：質譜儀參數設置；

步驟2.2：以質荷比50-1000每間隔 0.1-1組成一級質譜母離子Q1等于二級質譜子離子 Q3的離子對，即 Q1=Q3，對上述離子對以采集方式為MRM-IDA-EPI進行分段跑樣；

步驟2.3：對每個文件找出一級質譜母離子Q1在相應時間被裂解所對應的二級質譜子離子Q3及二級質譜子離子Q4、Q5，峰保留時間(RT)；

步驟2.4：以采集方式為MRM對步驟2.3所篩選出的離子對進行分段跑樣，然后利用 Analyst數據處理軟件的定量積分方法選出峰強度在1000cps以上的離子對；

步驟2.5：對步驟2.4篩選出來的離子對再次以采集方式為 MRM-IDA-EPI進行分段跑樣，進一步對一級質譜母離子Q1，二級質譜子離子 Q3、Q4，峰保留時間進行核對校準，去卷積，建立二級質譜子離子及保留時間為標簽的基礎代謝數據庫；

步驟3：檢測不同類型的待測樣品

步驟3.1：制備不同類型的待測樣品，裝入進樣瓶中，上機待測；

步驟3.2：以采集方式為 MRM-IDA-EPI進行分段跑樣，利用步驟2.5所建立的基礎代謝數據庫中的離子對信息及保留時間，檢測不同類型的待測樣品中的小分子代謝物。

進一步的，步驟1.1中所述的體積比例為血漿：冰甲醇=1:3-1:5。

進一步的，所述的冰甲醇為液態甲醇在-20℃冰箱中冷藏5-6小時制成。

進一步的，步驟1.2所述的重量比例為組織：提取液=1:10。

進一步的，所述的提取液為甲醇與水按照體積比例2:1混合制成。

進一步的，步驟1所述的基礎樣品制備還包括尿液樣品制備：取出凍存的尿液樣本，解凍后取一定量的尿液于EP管中，按照體積比例加入超純水，經過渦旋和離心后取一定量的上清液于新的EP管中，冷凍保存。

進一步的，所述的體積比例為尿液：超純水=1:2。

進一步的，取等量的尿液樣品與血漿樣品或者組織樣品或者血漿樣品和組織樣品，混合均勻后裝入進樣瓶中，上機待測。

優選的，步驟2.1、2.4、2.5中所述的分段跑樣的每個文件的離子對數量分別為30-80、500-800、30-80。

本發明的有益效果為：