[發(fā)明專利]熒光定量PCR法檢測外周血生存素(Survivin) mRNA的試劑盒

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• 申請日: 2017-12-01
• 公開（公告）號: CN109868305A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設計）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權）人: 安徽普元生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.外周血生存素(Survivin) mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，特征為：包含紅細胞裂解液、總RNA抽提試劑、無RNA酶的水、反轉錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉錄酶儲存液、PCR反應液、探針、標準品、對照品；除標準品用TE溶解外，其他各種溶液所用溶劑均為純化水；

紅細胞裂解液的配制方法為在1000ml水中加入8.29克氯化銨，1.00克碳酸氫鉀，37.2mg Na2EDTA, pH值為7.2-7.4；

總RNA抽提試劑的主要成分為苯酚，此外還含有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇；

無RNA酶的水制備方法為：向去離子水加入焦炭酸二乙酯，至體積終濃度為0.05%，22-25℃放置10-12小時后，121℃，20min高壓，22-25℃放置備用；

反轉錄緩沖液包含9.1umol/L Oligo(dT)_12-18、3.6U/ul RNA酶抑制劑、182mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、273mmol/L氯化鉀、11mmol/L氯化鎂、純化水；其中182mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為8.3；

逆轉錄酶儲存液包含20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鈉、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫蘇糖醇、體積比為50%的甘油、體積比為0.01%的Nonidet p-40、200U/ul逆轉錄酶、純化水；其中20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為7.5；

dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽-純化水溶液，pH 7.0-7.5，四種dNTP濃度均為10mmol/L；

PCR反應液包含18.5mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液、2.78mmol/L氯化鎂、92.6mmol/L氯化鉀、0.37mmol/L上下游引物、0.1U/ul Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/LdCTP、400nmol/L dGTP、400nmol/L dTTP、水；其中18.5mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液在25℃條件下，pH值為8.3；

上下游引物序列分別為：

P1：5'-AGGCTGGGAGCCAGATGAC-3'；

P2： 5'-GCAACCGGACGAATGCTTT-3'

探針為熒光標記探針，其序列為：

5'-FAM-ACCCCATAGAGGAACATA-TAMRA-3'

探針的濃度為: 2umol/L,,TE溶液溶解,TE溶液的組成為10mmol/L 三羥甲基氨基甲烷-鹽酸, lmmo1/L乙二胺四乙酸,水;

標準品的序列為:

GCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAAGGAGCTGGAAGGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACATAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGTTTGA

標準品濃度為: 2×10⁶copies/ul, TE溶液溶解, TE 溶液的組成為10mmol/L 三羥甲基氨基甲烷一鹽酸,,lmmol/L 乙二胺四乙酸,純化水;

對照品分為陽性對照品與陰性對照品,陽性對照品為含有Survivin cDNA的樣品,濃度為10⁴copies/μ1, TE溶解,陰性對照品為外周血總RNA的反轉錄產物。

2.如權利要求1所述外周血生存素(Survivin) mRNA熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征是：該試劑盒的規(guī)格為10人份/盒；每盒中各組分的量為：紅細胞裂解液1瓶、30ml/瓶；總RNA抽提試劑1瓶、10ml/瓶；無RNA酶的水1瓶、8ml/瓶；反轉錄緩沖液1管、27.5ul管；dNTP混合物1管、5ul/管；逆轉錄酶儲存液1管、2.5ul/管；PCR反應液1管、216ul/管；探針1管、24ul/管；標準品1管、15ul/管；陽性對照品1管、1ml/管；陰性對照品1管、1ml/管。