[發明專利]一種牛肉多肽的制備方法

在審

• 申請號: 201711242659.8
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN107811300A
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 郝學財
• 申請（專利權）人: 天津春發生物科技集團有限公司
• 主分類號: A23L33/18
• 分類號: A23L33/18
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司12211
• 代理人: 張會雪

1.一種牛肉多肽制備方法，其特征在于：該方法包括以下步驟：

(1)牛肉酶解物的制備：將新鮮牛肉使用絞肉機進行攪碎，而后置于反應器中，加入蒸餾水攪拌混勻，在溫度50℃、pH8.5條件下，采用胰蛋白酶進行酶解，酶解后滅酶、過篩分離得到牛肉酶解物；

(2)牛肉多肽的超濾分離：將牛肉酶解物通過陶瓷膜設備過濾后，分別經過截留分子量5KD、2.5KD和1KD超濾膜超濾進行分級制備，收集1KD-2.5KD分子量的肽段(通過感官評價發現，該肽段最具牛肉風味，醇厚飽滿)，低溫凍干；得超濾肽段；

(3)牛肉多肽的凝膠分離：將步驟(2)得到的超濾肽段用去離子水進行復溶，超聲處理，離心，取上清液，經過Sephadex G10凝膠分離，自動餾分收集器收集，每管收集4mL，收集管15～25的合并液；低溫凍干，即得凝膠分離肽段；

(4)牛肉多肽的反相純化：將步驟(3)得到的凝膠分離肽段，經過反相色譜純化收集洗脫峰，分別收集保留時間為2.58min、2.72min洗脫液，多次進樣，合并，然后冷凍干燥，得到肽段A和肽段B，肽段A、肽段B即為本發明的牛肉多肽。

2.根據權利要求1所述的一種牛肉多肽制備方法，其特征在于：所述牛肉酶解物的制備為：將新鮮牛肉使用絞肉機進行攪碎，稱取攪碎后牛肉100g，放入500mL三口燒瓶中，加入100g水，加入胰蛋白酶，溫度50℃、調節pH8.5、1.0‰添加量進行酶解，酶解2h后，于90℃滅酶15min，過80目篩網去除殘渣，得到牛肉酶解液。

3.根據權利要求1所述的一種牛肉多肽制備方法，其特征在于：所述步驟(2)為：

陶瓷膜過濾：將牛肉酶解液加入罐中，打開泵進口閥、膜組件進出口閥門、回罐管路的閥門，啟動循環泵，分批加入原料液，確保料罐內的液位正常，保證離心泵的穩定運行，打開組件滲透側出口收集清液，操作壓力控制為0.1-0.2Mpa；

超濾膜過濾：陶瓷膜預處理后的牛肉酶解液，由輔泵吸入，經主泵提高壓力后送入膜組件，順序為5KD、2.5KD和1KD超濾膜組件；

操作壓力：5000分子量有機膜10～15bar、2500分子量有機膜12～16bar、1000分子量有機膜15～18bar；料液流速:20～60L/h，物料溫度30～50℃；

首先打開5000Da超濾膜組件進口閥和出口閥，關閉2500Da和1000Da超濾膜組件進出口閥，收集一級透過液和截留液；一級透過液送入膜組件，打開2500ka超濾膜組件進口閥和出口閥，關閉5000Da和1000Da超濾膜組件進出口閥，收集二級透過液和截留液；二級透過液送入膜組件，打開1000Da超濾膜組件進口閥和出口閥，關閉5000Da和2500Da超濾膜組件進出口閥，收集三級透過液和截留液；

收集分離后的大于5KD、2.5-5KD、1-2.5KD和小于1KD這四段，-40℃進行冷凍干燥；選擇1-2.5KD肽段進行凝膠分離。

4.根據權利要求1所述的一種牛肉多肽制備方法，其特征在于：所述步驟(3)為：

將步驟(2)得到的1-2.5KD樣品用去離子水進行復溶(樣品與去離子水質量比例為1：19)，超聲處理，離心，取上清液，過0.2μm微孔濾膜得濾液，取0.5mL濾液過SephadexG-10(60cm×1cm)玻璃柱，以去離子為洗脫液，自動收集器收集，每管收集4mL，收集管號15～25的收集液，合并，-40℃進行冷凍干燥后，進行反相純化。

5.根據權利要求1所述的一種牛肉多肽制備方法，其特征在于：所述步驟(4)為：

將步驟(3)低溫凍干的樣品用0.02％TFA的水復溶，超聲，離心，取上清液；

反相純化條件：Agilent1200HPLC；選用ZorbaxXDB-C18(4.6×250，5um)；柱溫為30℃；流動相A為0.02％TFA，B為0.02％TFA的乙腈；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL；檢測波長為220nm，分別收集保留時間為2.58min、2.72min洗脫液，多次進樣，合并，然后冷凍干燥，得到肽段A和肽段B，肽段A、肽段B即為本發明的牛肉多肽。