[發明專利]用于豬傳染性胃腸炎病毒檢測的DPO引物組、含有該引物組的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201711241581.8
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN107937607B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 徐義剛;王紫微;王麗;周晗;唐麗杰;李一經
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種用于豬傳染性胃腸炎病毒檢測的DPO引物組、含有該引物組的試劑盒及其應用。所述的用于豬傳染性胃腸炎病毒檢測的DPO引物組由上游引物和下游引物組成。此外，本發明采用該DPO引物組結合實時熒光定量PCR方法，建立了一種特異、快速檢測豬傳染性胃腸炎病毒的DPO?real time RT?PCR檢測方法，該方法簡單、特異性強、靈敏度高，能夠實現現有檢測技術所無法完成的定量、快速、特異、敏感的結果判定。因此，本發明的提出為豬傳染性胃腸炎病毒的快速準確檢測提供了新的技術手段。

技術領域

本發明涉及一種用于豬傳染性胃腸炎病毒檢測的引物組、含有該引物組的試劑盒及其應用，特別涉及一種用于豬傳染性胃腸炎病毒進行定性、定量檢測的雙啟動寡核苷酸(DPO)引物組、含有該引物組的試劑盒及其應用。本發明屬于生物檢測技術領域。

背景技術

豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種高度接觸性、急性消化道傳染病。以嘔吐，嚴重腹瀉和脫水為特征，危害嚴重，是影響養豬業發展的主要病毒性傳染病之一，且該病經常與豬流行性腹瀉與豬輪狀病毒混合感染。病豬和帶毒豬是主要傳染源，經糞便、嘔吐物、乳汁、鼻液和呼出的氣體排出病毒，污染飼料、飲水、空氣、車輛、工具和環境，經消化道和呼吸道傳染給易感豬，死亡率高，嚴重危害豬業發展。

目前常用的臨床診斷的方法包括病理學檢查、血清學檢測和RT-PCR檢測等，例如王劭等(豬傳染性胃腸炎病毒RT-PCR檢測方法的建立，王劭等，動物醫學進展，2007，28(11)：12-16)公開了一種豬傳染性胃腸炎病毒RT-PCR檢測方法，但RT-PCR檢測引物設計過程復雜，需要對引物參數進行反復優化，有時即使反復優化過后仍然避免不了非特異性擴增及引物二聚體的存在。而且特異性差，避免不了非特異性擴增的出現。為解決此問題，本發明利用雙啟動寡核苷酸引物，即DPO引物，通過對豬傳染性胃腸炎病毒特異性N基因序列DNAMAN比對，選取其高特異性序列進行DPO引物設計，建立了豬傳染性胃腸炎病毒DPOreal-time RT-PCR檢測方法，DPO引物特異性高，退火溫度范圍寬，避免了傳統方法中反復優化反應的麻煩。

本發明檢測方法特異強、敏感高，顯著提高了對豬傳染性胃腸炎病毒的檢測效率及其敏感性，為豬傳染性胃腸炎病毒的檢測提供了重要的技術支持。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種能夠特異的、靈敏的檢測豬傳染性胃腸炎病毒的DPO-real time RT-PCR檢測方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：

為建立特異、快速檢測豬傳染性胃腸炎病毒的DPO-real time RT-PCR檢測方法，本研究針對測豬傳染性胃腸炎病毒的N基因設計了一對雙啟動寡核苷酸(DPO)引物，建立了豬傳染性胃腸炎病毒DPO-real time RT-PCR檢測方法。試驗結果顯示，本發明方法的檢測下限為2.21×10¹copies/ul，在40℃-65℃退火溫度范圍內均可高效擴增靶基因片段，表明該方法退火溫度范圍寬，同時DPO引物特異性強，PCR反應過程中不會產生非特異性擴增。利用該方法對采集的128份樣品進行檢測，共計檢出65份豬傳染性胃腸炎陽性樣品，經國標法(SN/T 1446-2010)復驗，兩者檢測結果一致，顯示了良好的實用性。

本發明的一種用于豬傳染性胃腸炎病毒檢測的DPO引物組，其由上游引物和下游引物組成，所述的上游引物以及下游引物的序列如下所示：

上游引物：5’CTGTTCTTGCCGCACTTAAAAIIIIIGGTGTTGAC3’

下游引物:5’TAGCTCCATAAAATCTTGTCACATCIIIIITACCTGCAG3’

其中，I表示次黃嘌呤核苷。