[發明專利]雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶及其多克隆抗體

有效

• 申請號: 201711241067.4
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN107841490B
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發明（設計）人: 宮春杰;童心語;薛棟升;胡征;楊波;王毅
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C07K16/40;C07K16/06;C07K1/22
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

1.一種雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶，其特征在于：所述雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一種編碼權利要求1所述的雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶的基因，其特征在于：所述雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶基因的堿基序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一種制備雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶的多克隆抗體的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶為抗原，免疫小鼠制備抗血清；

2)純化抗血清得到雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶的多克隆抗體；

所述雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶的制備方法為：

1.1)利用PCR技術擴增SEQ ID NO.2所示的堿基序列；

1.2)將SEQ ID NO.2所示的堿基序列克隆入載體質粒中，構建雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶的表達載體；

1.3)將表達載體轉化入大腸桿菌感受態菌體中得到重組菌體，依次經擴大培養、誘導表達、收集菌體、破碎菌體和純化蛋白過程得到雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶蛋白；

所述純化抗血清的方法為：將雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶蛋白與Ni-NTA偶聯制備成抗體純化層析柱，再將待純化的抗血清與PBS按照1:1比例混合后經過抗體純化層析柱，待抗血清中的抗體與雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶蛋白結合完全后用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫，獲得純化的雙功能亞甲基四氫葉酸脫氫酶/環化酶的多克隆抗體；

所述步驟1.1)中，PCR技術擴增所用的引物為：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示；

所述步驟1.2)中載體質粒為pET21a(+)；

所述步驟1.3)中，大腸桿菌感受態菌體為大腸桿菌BL21感受態菌體；

所述步驟1.3)中，所述純化蛋白過程中利用Ni-NTA親和層析色譜柱進行蛋白純化。