[發明專利]基于唾液蛋白質組學的肝癌生物標志物檢測的方法

在審

• 申請號: 201711239937.4
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN108132350A
• 公開（公告）日: 2018-06-08
• 發明（設計）人: 吳正治;丁峰;孫珂煥;曹美群;黃飛娟;范大華;姚永超
• 申請（專利權）人: 深圳市老年醫學研究所;吳正治
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 北京華智則銘知識產權代理有限公司 11573
• 代理人: 陳向敏

1.基于唾液蛋白質組學的肝癌生物標志物檢測的方法，其特征在于，具體步驟如下：

(1)樣品蛋白提取：樣本中加入5％的裂解緩沖液進行渦旋混勻，超聲60s，振幅22％室溫提取30min；15000r/min、4℃離心20min，取出上清；收集上清，分裝分裝后凍存于-80℃；

(2)蛋白定量：采用Bradford法測定提取的蛋白濃度，先將樣本用裂解緩沖液進行一定倍數稀釋使其終濃度落在標曲范圍內，稀釋好的樣本和標準品各取10μl分別和300μl蛋白定量染料避光反應20min，用酶標儀同時測定標準品和樣本在595nm下的吸光值，根據標準品每管吸光值和濃度的關系繪制標準曲線，根據曲線公式計算各樣品蛋白濃度；

(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于離心管中；加入4μl還原劑，60℃反應1h；加入2μl的半胱氨酸阻斷劑，室溫反應10min；將還原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超濾管中，12000r/min離心20min，棄掉收集管底部溶液；加入iTRAQ試劑盒中的溶液緩沖液100μl，12000轉離心20min，棄掉收集管底部溶液，重復3次；更換新的收集管，在超濾管中加入胰蛋白酶，總量4μg，體積50μl，37℃反應過夜；次日，12000r/min離心20min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50μl溶解緩沖液，12000r/min再次離心20min，與上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的樣品；

(4)iTRAQ標記：從冰箱中取出iTRAQ試劑，平衡到室溫，將iTRAQ試劑離心至管底；向每管iTRAQ試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底；取50μl酶解后的樣品轉移到新的離心管中；將iTRAQ試劑添加到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應2h；加入100μl水終止反應；從4組樣品中各取出1ul混合，用Ziptip脫鹽后進行MALDI-TOF-TOF鑒定，確認標記反應良好；混合標記后的樣品，渦旋振蕩，離心至管底；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用；

(5)高pH條件下的反相色譜分離：所需試劑的調配：流動相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流動相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水調pH值到10；混合標記后的樣品用100ul流動相A溶解，14000r/min離心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA進行分離，檢測系統情況；取100ul準備好的樣本上樣；流速0.7ml/min，得到分離梯度數據；

(6)ABI-5600進行蛋白質分析：所需試劑的調配：流動相A：100％超純水，0.1％甲酸；流動相B：100％乙腈，0.1％甲酸；將高pH反相分離得到的組份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸復溶；12000r/min離心10min，吸取上清上樣，上樣體積10μl，采取夾心法上樣；裝載泵流速350nl/min，15min；分離流速350nl/min，得到分離梯度數據；

(7)質譜數據分析：在選擇數據庫時，若為已經測序生物，直接選用該物種數據庫，若為非測序生物，則選擇與被測樣品最為相關的大類蛋白質組數據庫；采用ABI-5600型質譜儀進行iTRAQ的質譜分析；

(8)檢測結果：對肝癌和正常對照組進行對比實驗，定量蛋白質組學研究結果顯示：鑒定1297個蛋白；與正常對照組相比，肝癌中鑒定到的1.5倍以上表達差異的顯著差異蛋白共140個，其中上調蛋白64個，下調蛋白76個；差異蛋白列表如下：上調蛋白如下：

1)檢索號為P01623，基因注釋為Ig kappa chain V-III region WOL；

2)檢索號為P49221，基因注釋為Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 4；

3)檢索號為O60635，基因注釋為Tetraspanin-1；

4)檢索號為Q96L46，基因注釋為Calpain small subunit 2；

5)檢索號為P04179，基因注釋為Superoxide dismutase[Mn],mitochondrial；

6)檢索號為P01770，基因注釋為Ig heavy chain V-III region NIE；

7)檢索號為P01598，基因注釋為Ig kappa chain V-I region EU；

8)檢索號為Q66K66，基因注釋為Transmembrane protein 198；

9)檢索號為P04181，基因注釋為Ornithine aminotransferase,mitochondrial；

10)檢索號為P01834，基因注釋為Ig kappa chain C region；

11)檢索號為P83593，基因注釋為Ig kappa chain V-IV region STH(Fragment)；

12)檢索號為Q9BPV8，基因注釋為P2Y purinoceptor 13；

13)檢索號為P22532，基因注釋為Small proline-rich protein 2D；

14)檢索號為Q6UW32，基因注釋為Insulin growth factor-like family member 1；

15)檢索號為P04632，基因注釋為Calpain small subunit 1

16)檢索號為P15328，基因注釋為Folate receptor alpha；

17)檢索號為P00738，基因注釋為Haptoglobin；

18)檢索號為P31949，基因注釋為Protein S100-A11；

19)檢索號為P02788，基因注釋為Lactotransferrin；

20)檢索號為P13473，基因注釋為Lysosome-associated membrane glycoprotein 2；

21)檢索號為P01624，基因注釋為Ig kappa chain V-III region POM；

22)檢索號為P01764，基因注釋為Ig heavy chain V-III region 23；

23)檢索號為P01040，基因注釋為Cystatin-A；

24)檢索號為P01743，基因注釋為Ig heavy chain V-I region HG3；

下調蛋白如下：

1)檢索號為P16870，基因注釋為Carboxypeptidase E；

2)檢索號為P22626，基因注釋為Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1；

3)檢索號為P58499，基因注釋為Protein FAM3B；

4)檢索號為O43852，基因注釋為Calumenin；

5)檢索號為Q9BRZ2，基因注釋為E3 ubiquitin-protein ligase TRIM56；

6)檢索號為Q04917，基因注釋為14-3-3 protein eta；

7)檢索號為P23280，基因注釋為Carbonic anhydrase 6；

8)檢索號為Q9P0M2，基因注釋為A-kinase anchor protein 7 isoform gamma；

9)檢索號為Q15493，基因注釋為Regucalcin；

10)檢索號為P01036，基因注釋為Cystatin-S；

11)檢索號為Q14289，基因注釋為Protein-tyrosine kinase 2-beta；

12)檢索號為P80303，基因注釋為Nucleobindin-2；

13)檢索號為Q16378，基因注釋為Proline-rich protein 4；

14)檢索號為P02808，基因注釋為Statherin；

15)檢索號為Q7Z5M8，基因注釋為Abhydrolase domain-containing protein 12B；

16)檢索號為Q8NI35，基因注釋為InaD-like protein；

17)檢索號為P15374，基因注釋為Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozymeL3；

18)檢索號為P08571，基因注釋為Monocyte differentiation antigen CD14；

19)檢索號為Q9GZZ8，基因注釋為Extracellular glycoprotein lacritin。