[發明專利]篩選肺炎鏈球菌用固體培養基的制備方法

在審

• 申請號: 201711236165.9
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN107723337A
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發明（設計）人: 陳道遠;陳元芬;杜洪波;文彬
• 申請（專利權）人: 成都歐林生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/14
• 分類號: C12Q1/14;C12R1/46
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，具體涉及篩選肺炎鏈球菌用固體培養基的制備方法。

背景技術

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)于1881年首次由巴斯德分離出，是大葉性肺炎、腦膜炎、支氣管炎的主要致病源之一，它也能引起中耳炎、鼻竇炎和菌血癥等。肺炎鏈球菌感染是在全球范圍內引起死亡的重要原因之一。美國有資料顯示，估計每年有40～50萬人患肺炎球菌性肺炎，病死率為5％～10％。在用疫苗可預防兒童死亡的疾病中，肺炎鏈球菌引起的疾病排名第一。隨著抗菌素的大量使用，耐藥菌株與日俱增，醫學界再次關注疫苗的研發。肺炎球菌目前已發現90多種血清型。其細菌表面莢膜具有抗原性，再將肺炎球菌多糖共價連接到載體蛋白使之成為胸腺依賴性(TD)抗原，能夠對嬰幼兒和老人產生抗體，免疫效果有效提高。現有疫苗均是提取其莢膜多糖為原料制得。

自肺炎疫苗研發以來，由于其莢膜多糖產量較低，只有通過盡量擴大生產規模，以達到提高多糖產量的目的，因此生產成本較高。提高多糖產量可從篩選優質菌種、優化發酵工藝、優化純化工藝等關鍵工序著手。篩選莢膜較厚的菌種，即是關鍵工藝之一，從源頭上解決這一問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是現有培養基培養肺炎鏈球菌獲得的莢膜多糖產量較低，目的在于提供篩選肺炎鏈球菌用固體培養基的制備方法，采用本發明培養基獲得莢膜較厚的菌種，利于提高莢膜多糖的產量，提高生產效率、降低生產成本。

本發明通過下述技術方案實現：

篩選肺炎鏈球菌用固體培養基的制備方法，包括以下步驟：

步驟1，稱取瓊脂，加注射用水溶解后定容到所需體積的90％；

步驟2，將所述步驟1溶解后的溶液進行濕熱滅菌，冷卻后備用；

步驟3，稱取以下原料：

溶劑為水的相對用量為1000ml：

含氮源為胰酪胨：20～85g，胰胨：25～80g，精選大豆胨：15～70g，大豆胨：20～85g，酸水解酪蛋白：15～75g，酵母提取物：15～35g，酵母浸粉：10～45g的其中三種；

碳源為葡萄糖：15～55g；

鹽類為K₂HPO₄：3.0～15.0g，NaCl：2.0～10.0g，MgSO₄·7H₂O：0.1～4.0g，CaCl₂：0.10～0.18g；

微量元素為L-半胱氨酸鹽酸鹽：0.12～1.80g，煙酸：0.5～1.2mg，腺嘌呤：5.5～10.5mg，FeSO₄：3.5～7.5mg；

瓊脂10～15g；

步驟4，采用注射用水對所述步驟3稱取的原料進行溶解，將溶解后的混合溶液進行定容到所需體積，并調節pH值；

步驟5，將所述步驟4獲得的混合溶液進行除菌處理，再加入所述步驟2滅菌冷卻后的瓊脂培養基中，倒入平皿，制得固體培養基。

優選地，所述步驟1中，向瓊脂中加入注射用水并升溫至95℃進行溶解；所述步驟2中將瓊脂溶液冷卻至55～60℃備用。

優選地，所述步驟2中，濕熱滅菌具體操作為：濕熱滅菌溫度為117～122℃，壓強為0.09～0.12MPa，滅菌時間為15～30min。

優選地，所述步驟4中，采用質量濃度為10％的NaOH溶液調節pH值至7.0～7.8。

優選地，所述所述步驟5中，在無菌操作條件下經0.2μm的過濾減壓過濾除菌。

優選地，所述固體培養基的配方組成為，溶劑為水的相對用量為1000ml：

含氮源為胰酪胨：60g，胰胨：55g，精選大豆胨：45g，大豆胨：50g，酸水解酪蛋白：45g，酵母提取物：25g，酵母浸粉：25g的其中三種；

碳源為葡萄糖：32g；

鹽類為K₂HPO₄：8.0g，NaCl：6.0g，MgSO₄·7H₂O：1.5g，CaCl₂：0.14g；

微量元素為L-半胱氨酸鹽酸鹽：1.10g，煙酸：0.8mg，腺嘌呤：7.0mg，FeSO₄：7.5mg；

瓊脂13g。

本發明與現有技術相比，具有如下的優點和有益效果本發明篩選肺炎鏈球菌用固體培養基的制備方法，