[發明專利]一種從PCR混合產物中分離回收大小差異微小的核酸分子的方法

在審

• 申請號: 201711235686.2
• 申請日: 2017-11-30
• 公開（公告）號: CN108048448A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 戎均康;劉曉;曹躍芬
• 申請（專利權）人: 浙江農林大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

本發明涉及一種從PCR混合產物中分離回收大小差異微小的核酸分子的方法，其包括以下步驟：經PCR獲得含有目的片段的混合DNA產物；通過聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳將混合物中的不同DNA分子分開；核酸染料DNAgreen染色PAGE膠片；在紫外燈下切割下含有目的片段凝膠部分，用研磨棒將凝膠研磨至稀泥狀；在凝膠中加入TE溶液，加熱處理；混合物離心處理，保留上清液；使用實驗室現有的普通的PCR產物純化試劑盒從上清液中回收獲得含有目的片段的溶液；將以上溶液直接作為PCR模板，擴增產物直接測序，獲得目的DNA分子的序列信息。本發明具有以下優點：快捷方便；成本低；安全；質量高；效果好；資源整合利用。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種從PCR混合產物中分離回收大小差異微小的核酸分子的方法。

背景技術

高等生物染色體組本身較為龐大，加之進化過程中出現的染色體加倍和基因重復等現象，使得其基因組更為復雜。如人是二倍體生物，有46條染色體，基因組總量達到3Gb；棉花有二倍體和四倍體之分，四倍體棉種有52條染色體，最新的陸地棉基因組測序數據顯示其基因組總量達2.5Gb；小麥分為一粒小麥、二粒小麥和六倍體普通小麥，普通小麥有42條染色體，基因組總量高達17Gb，且80%以上是重復序列。在基因組序列克隆過程中，等位基因、同源基因和重復序列等的存在，使得某些位置很難提取到單一的目的片段，PCR獲得的往往是多種DNA分子的混合產物。

近年來，深度測序逐漸流行，但其價格的昂貴使得受眾面偏低，且該方法屬于大數據信息量獲取。對于小樣本量單基因測序，Sanger測序法依然是最好的選擇，該方法經濟且高效，也是深度測序檢測后進行進一步基因鑒定的主要手段。但是Sanger測序存在其局限性，當PCR產物中含有兩種及以上DNA分子時，測序過程會出現雙峰或雜峰影響測序進程，導致測序不準確或失敗。因此，在利用Sanger直接測序時，需要使用嚴格的特異性引物以獲得單一的DNA分子。若得到的PCR產物中仍然含有多種片段，則需要通過凝膠電泳等方法進行分離純化最終得到單一的DNA分子產物。

本實驗室主要利用SSR（簡單重復序列）標記從事棉花相關性狀基因的定位研究。在實驗過程中，我們發現一些非特異性條帶有時具有重要的科研價值，因此偶爾需要利用凝膠分離回收此類片段大小具有微小差異的核酸分子進行測序。目前國內市場上，瓊脂糖凝膠回收試劑盒的開發已經很成熟，大多采用核酸在高鹽濃度下結合到二氧化硅基質而在低鹽環境下脫離的原理。該種類試劑盒十分經濟有效，在一般實驗室使用的十分普遍，但瓊脂糖凝膠分辨率較低，只能分離開大小差異較大的核酸分子，對于微小差異的片段則需要使用更高分辨率的PAGE膠進行分離。目前從PAGE膠回收核酸采取的主要方法是：1）將PAGE膠破碎后在60度水浴溶解3小時以上；2）使用酚氯仿抽提去除雜質；3）乙醇沉淀核酸；4）加水溶解獲得核酸產物，此方法過程中使用的酚氯仿屬于高腐蝕性有毒物質，不夠安全。也可以將PAGE膠裝入透析帶進行電洗脫，但此法不僅操作麻煩且十分耗時。已有的PAGE膠回收試劑盒同樣也需要將PAGE膠破碎后在60度水浴溶解3小時，且價格較貴（300元以上/50次）。此外，也有發明專利將含有目的核酸分子的聚丙烯酰胺膠放在瓊脂糖膠孔中再次電泳，再從瓊脂糖膠中回收核酸片段，該方法增加了操作上的步驟和回收的風險。

參考已有的方法，結合本實驗室的實際情況和實驗的需求，我們做了以下考慮：1、現有的PAGE膠回收試劑盒回收時間過長（通常需要4小時以上），其價格較高（300元以上/50次），且只能回收小片段（500bp以下），而一般實驗室使用PAGE膠回收試劑盒的頻率較低，對于較大的片段試劑盒也不是很有效，可能造成不必要的浪費；2、應盡量避免有毒有害物質的使用，減少實驗步驟，使實驗更加安全簡便；3、由于所得到的回收產物需要進行下一步PCR實驗，因此回收產物需要去除雜質，不能含有不利于下一步實驗的有害物質；4、本實驗室常年使用PCR產物純化試劑盒（100元/50次），是否可以與之結合使用從而有效利用實驗室現有資源獲得高質量的產物。基于這幾點考慮，我們創建了本發明，可以使用普通實驗室已有資源快速有效分離和提取大小差異微小的核酸片段。

發明內容