[發明專利]北方根結線蟲抗性鑒定方法

在審

• 申請號: 201711232005.7
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107980728A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 任艷;袁美;尹亮;石延茂;李雙鈴;崔瀟;李磊;江晨
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 北京中北知識產權代理有限公司11253
• 代理人: 孫靜靜

1.北方根結線蟲抗性鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)無菌花生毛狀根制備

選用粒大飽滿的20個花生品種的種子，清洗干凈，表面消毒，接種于無激素的MSB5培養基上，采用發根農桿菌A4侵染無菌培養6d的花生子葉誘導毛狀根，擴繁繼代培養；

(2)無菌胞囊線蟲懸浮液的制備

清洗上述發病根系，搗碎，過篩，濾液噴灑于40目、200目、325目和500目組合篩上，收集325目和500目上的線蟲和卵，獲得根結線蟲懸液和根結線蟲卵懸液；

(3)北方根結線蟲的接種于培養

將根結線蟲懸液或根結線蟲卵懸液，均勻接至不同花生品種的毛狀根培養皿上，盒蓋靜置1h，用膜封口，倒置于25℃培養42d獲得大量蟲卵和二齡幼蟲；

(4)抗性鑒定

調查記錄有根結根數占整個根系的百分率。

2.根據權利要求1所述的北方根結線蟲抗性鑒定方法，其特征在于：

根據計算結果和抗性評價標準，分別評價花生品種對北方根結線蟲的抗性，抗性分級標準:

免疫：無根結；

高抗：有根結根數占整個根系的10％以下；

抗病：有根結根數占整個根系的10％～30％；

感病：有根結根數占整個根系的30％～50％；

高感：有根結根數占整個根系的50％以上。

3.根據權利要求1所述的北方根結線蟲抗性鑒定方法，其特征在于：具體試驗過程如下：

(1)無菌花生毛狀根制備

選取粒大飽滿的20個花生品種的種子用自來水沖洗20-30min；在無菌條件下，用75％酒精浸泡花育45種子0.5-1min；然后再在0.1％升汞中浸泡15min，進行表面消毒；其次用無菌水洗滌花育45種子3～4次，每次3-5min；最后，用無菌刀在無菌濾紙上剝去花生種子的種皮，接種于無激素的MSB5培養基上；

在無菌條件下，接種環挑取于農桿菌A4菌株，在LB+50mg/L Kan的固體平板上化線接種后置于28℃恒溫培養箱中暗培養，待長出單菌落后挑取1個單菌落轉入10ml LB液體培養基中；其中，LB液體培養基中添加50mg/L Kan，于28℃、180r/min的搖床內暗培養復蘇21h；然后取0.05ml該菌液于上述液體培養基再次活化，使其達到對數生長期；最后使農桿菌的A600nm＝0.6～0.8時，采用發根農桿菌A4侵染無菌培養6d的花生子葉誘導毛狀根，擴繁繼代培養；

(2)無菌胞囊線蟲懸浮液的制備

收集上述花生根結樣品，將發病重、根結多的根系剪成長約1cm的小段，放入組織搗碎均漿機中，加水搗碎5～10min，形成線蟲與根組織碎片的混合物；

將混合物加入到1.0％NaClO溶液中，沒過根系，混合3min；將含有NaClO溶液的混合物倒入組合篩上，組合篩自上而下依次為40目、200目、325目和500目；

薄霧噴灑40目篩上的混合物，噴灑0.5h，使線蟲和卵從根組織內移到表面，至組合篩的底部；

取出組合篩中的325目篩，用無菌水噴淋沖洗，收集沖洗液體，獲得根結線蟲懸液，并配成200條/ml的濃度；

取出組合篩中的500目篩，用無菌水噴淋沖洗，收集沖洗液體，獲得根結線蟲卵懸液，離心，去除上清液，再加入200@10-6鏈霉素，繼續離心，去除上清液，以上過程重復3次；倒去上清液,加入無菌水離心5min，以上過程重復3次；最后一次倒去上清液，留下底部無菌線蟲懸浮液；

(3)北方根結線蟲的接種于培養

將上述根結線蟲懸液1ml或卵懸液1ml，均勻接至不同花生品種的毛狀根培養皿，盒蓋靜置1h，膜封口，倒置于25℃培養42d獲得大量蟲卵和二齡幼蟲；

(4)抗性鑒定

將步驟(3)的花生毛狀根漂洗干凈，調查記錄根結數量，計算供試群體根內有根結根數占整個根系的百分率。