[發明專利]一種肺癌EGFR L858R位點的ddPCR檢測方法及應用

在審

• 申請號: 201711231164.5
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN109762878A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 陳苗苗;黃昕;江螢;童慧娟
• 申請（專利權）人: 銘時基因科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6886
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 郭春遠

1.一種肺癌EGFR L858R位點的ddPCR檢測方法及應用，其特征在于，根據EGFR基因序列，設計一對包括上游引物和下游引物的擴增引物，根據L858R(2573T>G,COSM6224)突變序列，設計檢測野生型序列的探針和檢測突變型序列的探針，進一步的，采用上述引物和探針進行ddPCR，并優化出低頻突變檢出的最佳條件；應用該方法進行病人組織、血液等樣本的檢測；針對ctDNA中的肺癌靶向用藥相關的重要位點進行檢測分析，首先對肺癌患者外周血漿進行DNA抽提，再利用ddPCR技術檢測其中EGFR突變位點L858R的突變情況，并以此指導患者用藥。

2.如權利要求1所述的一種肺癌EGFR L858R位點的ddPCR檢測方法及應用，其特征在于，檢測方法及應用技術包括五個部分：

第一部分，對EGFR L858R位點突變進行檢測的方法包括以下步驟：

1)根據EGFR基因序列，設計特異性擴增外顯子21引物對；根據L858R突變序列設計分別檢測野生型模板和突變型模板的探針對；采用上述引物和探針，進行ddPCR，并優化出低頻突變檢測的最佳條件；

2)抽提樣本的核酸；選擇適合樣本類型的方法抽提核酸，所述樣本類型包括外周血細胞、外周血血漿/血清、體液、腔道的脫落物、病變組織；特別地，對于血液樣本的游離核酸抽提，步驟如下：

①.采血管的選擇；如果采用普通采血管，不能含有肝素，而且需要在4h內分離血漿/血清，如果血液不能及時處理，需選用含血細胞穩定技術的采血管，如Streck游離核酸采血管或PAXgene游離核酸采血管(Qiagen),本發明采用PAXgene游離核酸采血管采集血液樣本；

②.血漿/血清的分離；血漿的分離：第一步4℃、1900g、10min低速離心去除細胞；第二步4℃、16000g、10min高速離心進一步去除細胞來源核酸雜質；

③.裂解；每毫升血漿/血清加入100ul蛋白酶K和0.8ml緩沖液ACL，且每個樣本加入1ug載體RNA；60℃孵育30min；每毫升血漿/血清加入1.8ml緩沖液ACB；渦旋混勻,冰浴5min；

④.核酸吸附至硅膜，將第三步裂解液加入核酸吸附柱；

⑤.清洗；分別使用緩沖液ACW1、ACW2和96-100％乙醇清洗核酸吸附柱；

⑥.乙醇去除；56℃、10min揮發乙醇；

⑦.洗脫；20-100ul AVE洗脫核酸；

3)ddPCR檢測：

①.PCR體系的配置；在試劑準備區按照下表配置PCR體系：2×ddPCR預混液(不含dUTP)11ul，引物1(1-858-F)1.1ul，引物2(1-858-R)1.1ul，探針1(WTp-L858R)0.55ul，探針2(MTp-L858R)0.55ul，模板5.5ul，加水補齊至22ul；

②.加模板；在樣本制備區按照以下順序加入模板：空白對照、陰性對照、弱陽性對照、陽性對照；

③.微滴的生成；在微滴生成區，將20ul PCR反應液加入微滴生成卡的樣本孔，70ul微滴生成油加至微滴生成卡的加油孔，加樣結束后用密封墊密封微滴生成卡，然后置于微滴發生儀內，啟動并生成微滴；用移液器小心轉移微滴至effendorf 96孔PCR板，覆蓋上熱封膜，在熱封儀內以180℃、5s參數進行熱封；

④.PCR；經過退火溫度優化實驗，發現56.3℃退火15s，數字PCR效果最優；按照以下程序進行PCR：95℃10min，40個循環(94℃30s，56.3℃15s，72℃15s)，98℃10min，升降溫速率2℃/s；

⑤.讀板；提前預熱Bio-rad QX200儀器；打開QuantaSoft程序，設置檢測區域、檢測參數及FAM/HEX檢測通道，開始讀板；根據讀板結果，判斷樣本陽性或者陰性；

第二部分，提供一種對EGFRL858R位點突變進行檢測的試劑盒，適用于EGFR基因第21外顯子第858位賴氨酸突變為精氨酸的檢測；所述試劑盒包括PCR引物探針、反應體系、反應條件、陰性對照DNA樣本、弱陽性對照DNA樣本、陽性對照DNA樣本；以下內容：

引物和探針；合成以下寡核苷酸片段和修飾寡核苷酸片段，溶解于TE(10uM)；

PCR試劑；DNA聚合酶使用Bio-rad 2×ddPCR預混液(不含dUTP)；

反應體系與反應條件，與前述相同；

模板；空白對照為水，陰性對照為健康人白細胞基因組，弱陽性對照DNA樣本，抽提與樣本來源相同的正常材料的核酸，通過紫外分光光度計納米微滴定量后，加入0.1％-1％細胞系1975基因組，作為弱陽性對照，強陽性對照為細胞系1975基因組；

第三部分，提供一套獨有引物探針設計流程；

引物和探針；所述引物是指一種寡核苷酸、一小段單鏈DNA或RNA，是核酸合成反應時多核苷酸鏈進行延伸的出發點；所述探針是指一種Taqman探針，是一段帶有熒光標記、序列與目的基因互補的寡核苷酸片段；探針的5’端標記有報告基團，如FAM、VIC等，3’端標記有熒光淬滅基團，如BHQ1、TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號；隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5’-3’外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，即產生熒光信號；

引物設計原則：1)長度一般在15-30堿基之間，2)GC含量在40％-60％之間，3)四種堿基均勻分布，4)避免3個及以上連續堿基G或者連續堿基C，特別3’端避免此類結構，5)3’端序列決定引物的特異性，應與模板嚴格互補，6)3’端最后一個堿基不能是A；

探針的設計原則：1)長度一般在10-30堿基之間，2)GC含量在40％-60％之間，3)四種堿基均勻分布，4)避免3個及以上連續堿基G或者連續堿基C，5)Tm值比引物高2-5℃，6)5’端不含G，因為G能夠淬滅熒光信號；

針對單核苷酸突變SNP(Somatic Nucleiotide Polymophysm)，采用Taqman探針進行檢測，其設計流程如下：

A.查找序列；

在NCBI或者UCSC等數據庫，通過輸入目標單核苷酸突變的染色體位置信息，獲得該SNP以及其上下游100bp序列信息；

B.通過Primer3Plus設計引物和探針；

1)將以上引物探針設計原則，輸入Primer3Plus參數空格；

2)通過設置“Hyb Oligo Excluded Region”，迫使探針覆蓋SNP，如果SNP無法保證處于探針的最中間位置，確保其位于最中間位置上下游4堿基以內；

3)將輸入目標序列輸入空格；可將SNP序列改成小寫字母，以防止引物和探針設計區域出現偏差；

4)點擊“Pick Pimers”；

5)設計突變型探針時，將目標序列SNP換成突變型堿基，重復以上操作，注意前后引物保持一致；

C.適時調整設計參數；

1)如果設計探針5’端為G，可以調整探針位置進行改動；

2)如果探針引物設計難度大，可以考慮采用反向互補模板鏈重新設計；

D.通過PrimerBlast和In-Silico PCR工具確認引物的特異性；

1)將引物輸入PrimerBlast軟件，確認其與基因組其他位置錯配概率的高低；

2)在In-Silico PCR上確認引物擴增產物的特異性和引物的Tm值；

E.確認模板鏈的選擇；

在IDT Biophysics上輸入探針，并勾選“mismatch,dangling ends”,然后使探針SNP位點匹配對應突變堿基的互補堿基，計算完美匹配和不匹配之間的Tm差值(△Tm)；對于反向互補模板鏈，重復上述操作，選擇△Tm最大的作為模板鏈，重新回到步驟B設計探針；

第四部分，是提供一種通過基因檢測指導腫瘤靶向藥物用藥的方法；

所述腫瘤包括但不限于肺癌患者；

所述腫瘤靶向藥物是表皮生長因子受體抑制劑(EGFR-TKIs)，包括但不限于吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法特羅(afatinib)和達沙替尼(dasatinib)；

所述指導腫瘤靶向藥物用藥方法具體指，使用本發明方法檢測EGFR L858R突變，若檢測結果為陽性，則判定發生L858R突變，患者建議使用EGFR-TKIs，若檢測結果為陰性，則判定未發生L858R突變，建議進行EGFR其他位點突變的檢測，根據檢測結果進行用藥指導；

第五方面，是提供一種通過基因檢測進行腫瘤早期診斷的方法；

所述腫瘤包括但不限于肺癌患者；

將Taqman探針應用于數字PCR，可以實現極低濃度突變核酸的檢出(0.0625％)；腫瘤早期診斷存在核酸含量低、突變序列含量極低等技術瓶頸，本發明檢測靈敏度高，可用于腫瘤早期診斷；

所述腫瘤診斷的判斷方法具體指，使用本發明方法檢測EGFR基因L858R突變，若檢測結果為陽性，則判定發生L858R突變，有可能發生腫瘤，若檢測結果為陰性，則判定未發生L858R突變，在本方法檢測范圍內未發生腫瘤；

從健康人白細胞抽提基因組作為野生型模板，其中，白細胞抽提基因組以下稱“tgDNA”，從中國科學院細胞庫購買具有EGFR L858R突變的細胞系1975，經過細胞培養并抽提基因組，以下稱“1975”，基因組經紫外分光光度計納米微滴和ddPCR精確定量和突變驗證后，作為突變型模板。