[發(fā)明專利]ptna基因片段在生產(chǎn)丁醇中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711229869.3
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107988241B
• 公開（公告）日: 2020-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳麗杰;李穎;吳又多
• 申請（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/74;C12N1/21;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 劉慧娟;李馨

1.ptna基因片段在生產(chǎn)丁醇中的應(yīng)用，所述ptna基因片段如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述ptna基因片段編碼如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

所述應(yīng)用為構(gòu)建過表達(dá)ptna基因片段相關(guān)的生物材料；

所述ptna基因片段在梭菌內(nèi)過表達(dá)；

所述梭菌為丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述ptna基因片段相關(guān)的生物材料為下述一種：

(1)含有權(quán)利要求1所述的ptna基因片段的表達(dá)盒；

(2)含有權(quán)利要求1所述的ptna基因片段的重組載體或含有(1)所述表達(dá)盒的重組載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于，所述的(1)～(2)中任一項(xiàng)的生物材料中，還包含核苷酸序列為SEQ ID NO.3的硫解酶的啟動子。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：

(1)過表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將核苷酸序列為SEQ ID NO.3的硫解酶啟動子thl序列經(jīng)Pst I和Sal I酶切后與pIMP1質(zhì)粒連接，得到載體質(zhì)粒pIMP1-thl，以丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824基因組作為模板，利用PCR擴(kuò)增核苷酸序列為SEQ ID NO.1的ptna基因片段，將其與載體質(zhì)粒pIMP1-thl進(jìn)行連接從而構(gòu)建pIMP1-thl-ptna質(zhì)粒；

(2)過表達(dá)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增：將pIMP1-thl-ptna質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入E.coli DH5α進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒pIMP1-thl-ptna及測序驗(yàn)證核苷酸序列位點(diǎn)有無突變或缺失；

(3)過表達(dá)重組質(zhì)粒的甲基化：將核苷酸測序正確的重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入E.coliDH10B(pAN1)中進(jìn)行甲基化，得到甲基化質(zhì)粒pIMP1-thl-ptna；

(4)通過電轉(zhuǎn)化法，將步驟(3)所得甲基化質(zhì)粒pIMP1-thl-ptna轉(zhuǎn)化至丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum ATCC 824中，通過涂布于含有50μg/mL紅霉素抗性的TGY瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、篩選獲得含有甲基化質(zhì)粒pIMP1-thl-ptna的過表達(dá)丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC 824(pIMP1-thl-ptna)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述電轉(zhuǎn)化法中使用的電轉(zhuǎn)緩沖液為ETM溶液和ET溶液；其中ETM溶液的配方為：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄，4.4mM NaH₂PO₄及10mMMgCl₂；ET溶液的配方為：270mM蔗糖，0.6mM Na₂HPO₄及4.4mM NaH₂PO₄。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述過表達(dá)丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicumATCC 824(pIMP1-thl-ptna)能提高丁醇發(fā)酵中葡萄糖、果糖和菊芋水解液的利用率，以及提高丁醇的產(chǎn)量。