[發明專利]熱啟動TaqDNA聚合酶及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201711227574.2
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107828755B
• 公開（公告）日: 2021-01-12
• 發明（設計）人: 王丹;宋璐;趙世源;蔡一榮;曲俊杰;徐榿;李鐵男;趙倩;李望豐;謝占武
• 申請（專利權）人: 東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

1.一種熱啟動Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述熱啟動Taq DNA聚合酶是經抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體修飾的Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體購自日本東洋紡株式會社生命科學事業部，抗體名稱：monoclonal antibody for Hot Start PCRanti-Taq high，商品編號：TCP-101；

其中，所述Taq DNA聚合酶由GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1編碼；

抗體修飾方法如下：

根據GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大腸桿菌偏好密碼子，人工合成優化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后將優化的Taq DNA聚合酶基因片段構建到原核表達載體上，進行大腸桿菌轉化和篩選，獲得表達Taq DNA聚合酶的重組菌；然后依次進行誘導表達、細胞破壁、熱變性、梯度鹽析、透析和層析，完成Taq DNA聚合酶的濃縮和純化；最后，將抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體與Taq DNA聚合酶進行特異性結合，完成Taq DNA聚合酶的配基修飾，即為熱啟動Taq DNA聚合酶；

優化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

具體地，所述方法包括以下步驟：

(1)重組表達載體的構建及轉化：

人工合成優化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性內切酶對上述片段進行雙酶切，然后將其連入經NcoI和Not I雙酶切后的pET-28a載體中，得到重組表達載體pET-28a/Taq；將pET-28a/Taq轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取陽性克隆進行培養及鑒定，鑒定正確的陽性克隆即為表達Taq DNA聚合酶的重組菌；

(2)重組菌的誘導表達、細胞破壁及熱變性：

①挑取陽性克隆用LB液體培養基懸浮培養，37℃過夜培養后，轉接到相同的LB液體培養基中，37℃培養10小時至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入終濃度為0.5mM～1.5mM的IPTG誘導劑，37℃誘導培養10-12小時；

②將誘導培養得到的200mL菌液離心收集菌體，向菌體中加入預裂解緩沖液10mL，室溫靜置15min破菌；再加入等體積裂解緩沖液，于75℃熱變性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心10-15min，收集上清；

其中，所述預裂解緩沖液的配方為：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/mL溶菌酶，pH＝8.0；

所述裂解緩沖液的配方為：10mM Tris-HCl，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40，pH＝8.0；

(3)粗酶制備和純化：

③梯度鹽析：采用三步鹽析法沉淀Taq DNA聚合酶，具體如下：

第一步鹽析：向熱變性得到的上清中加入硫酸銨進行鹽析，然后離心，收集上清，進行透析；

第二步鹽析：向透析后的溶液中再次加入硫酸銨進行鹽析，然后離心，收集上清，進行透析；

第三步鹽析：向兩次鹽析透析后的溶液中加入硫酸銨，鹽析沉淀目的蛋白，然后離心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，對粗酶液進行透析；

④層析：采用陰離子交換法進行層析，回收目的蛋白酶液；

⑤透析：將目的蛋白酶液加入到透析袋中，用貯存緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液，透析后加入等體積甘油，即得純化的Taq DNA聚合酶酶液，于-20℃以下貯存；

其中，所述貯存緩沖液的配方為：40mM Tris-HCl，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM二硫蘇糖醇，1％吐溫20，1％Nonidet P40，pH＝8.0；

(4)抗體修飾：

將純化的Taq DNA聚合酶酶液與抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體混合孵育，即得熱啟動Taq DNA聚合酶；

步驟(3)中三步鹽析法具體如下：

第一步鹽析：向熱變性得到的上清中加入終濃度15％的硫酸銨，冰浴鹽析1小時，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心15-20min，收集上清，將上清轉移到透析袋中，用透析緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液；

第二步鹽析：向透析后的溶液中再次加入終濃度15％的硫酸銨，冰浴鹽析1小時，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心15-20min，收集上清，將上清加入到透析袋中，用透析緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液；

第三步鹽析：向兩次鹽析透析后的溶液中加入終濃度25％的硫酸銨，冰浴鹽析1小時，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心15-20min，收集沉淀，將沉淀用懸浮緩沖液溶解，得到粗酶液；將粗酶液加入到透析袋中，用透析緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液；

其中，所述透析緩沖液的配方為：20mM Tris-HClpH＝8.0；

第三步鹽析中用于溶解沉淀的懸浮緩沖液的配方為：20mM Tris-HCl，50mM葡萄糖，1mMEDTA，pH＝8.0；

步驟(3)中層析的具體操作如下：先用平衡緩沖液平衡色譜柱5個色譜柱柱體積，取0.45μm濾膜過濾后的粗酶液上樣，上樣后先用5個色譜柱柱體積的平衡緩沖液沖洗色譜柱，然后用5個色譜柱柱體積的濃度40％的洗脫緩沖液洗脫色譜柱，最后用5個色譜柱柱體積的濃度60％的洗脫緩沖液洗脫色譜柱，回收目的蛋白酶液；

其中，所述平衡緩沖液的配方為：20mM Tris-HClpH＝8.0；

所述洗脫緩沖液的配方為：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0；步驟(4)具體如下：

⑥將純化的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀釋液稀釋，將0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液與1mg/ml抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體按體積比2:1混合孵育；

⑦向上述混合體系中加入與0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等體積的酶稀釋液，即得熱啟動Taq DNA聚合酶，于-20℃以下貯存；

所述酶稀釋液的配方為：20mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM二硫蘇糖醇，0.5％吐溫20，0.5％Nonidet P40，50％甘油，pH＝8.0；

步驟(4)將Taq DNA聚合酶酶液與抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體于25℃孵育30min。

2.權利要求1所述熱啟動Taq DNA聚合酶的制備方法，其特征在于，根據GenBank公布的Taq DNA聚合酶基因序列D32013.1，按照大腸桿菌偏好密碼子，人工合成優化的Taq DNA聚合酶基因片段；然后將優化的Taq DNA聚合酶基因片段構建到原核表達載體上，進行大腸桿菌轉化和篩選，獲得表達Taq DNA聚合酶的重組菌；然后依次進行誘導表達、細胞破壁、熱變性、梯度鹽析、透析和層析，完成Taq DNA聚合酶的濃縮和純化；最后，將抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體與Taq DNA聚合酶進行特異性結合，完成Taq DNA聚合酶的配基修飾，即為熱啟動Taq DNA聚合酶；其中，所述抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體購自日本東洋紡株式會社生命科學事業部，抗體名稱：monoclonal antibody for Hot Start PCR anti-Taq high，商品編號：TCP-101；

優化的Taq DNA聚合酶基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

具體地，所述方法包括以下步驟：

(1)重組表達載體的構建及轉化：

人工合成優化的Taq DNA聚合酶基因片段，用NcoI和NotI限制性內切酶對上述片段進行雙酶切，然后將其連入經NcoI和NotI雙酶切后的pET-28a載體中，得到重組表達載體pET-28a/Taq；將pET-28a/Taq轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取陽性克隆進行培養及鑒定，鑒定正確的陽性克隆即為表達Taq DNA聚合酶的重組菌；

(2)重組菌的誘導表達、細胞破壁及熱變性：

①挑取陽性克隆用LB液體培養基懸浮培養，37℃過夜培養后，轉接到相同的LB液體培養基中，37℃培養10小時至菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入終濃度為0.5mM～1.5mM的IPTG誘導劑，37℃誘導培養10-12小時；

②將誘導培養得到的200mL菌液離心收集菌體，向菌體中加入預裂解緩沖液10mL，室溫靜置15min破菌；再加入等體積裂解緩沖液，于75℃熱變性60min，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心10-15min，收集上清；

其中，所述預裂解緩沖液的配方為：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，4mg/mL溶菌酶，pH＝8.0；

所述裂解緩沖液的配方為：10mM Tris-HCl，50mM KCl、1mM EDTA，1mM PMSF，0.5％Triton X-100，0.5％Nonidet P40，pH＝8.0；

(3)粗酶制備和純化：

③梯度鹽析：采用三步鹽析法沉淀Taq DNA聚合酶，具體如下：

第一步鹽析：向熱變性得到的上清中加入硫酸銨進行鹽析，然后離心，收集上清，進行透析；

第二步鹽析：向透析后的溶液中再次加入硫酸銨進行鹽析，然后離心，收集上清，進行透析；

第三步鹽析：向兩次鹽析透析后的溶液中加入硫酸銨，鹽析沉淀目的蛋白，然后離心，收集沉淀，溶解，得到粗酶液，對粗酶液進行透析；

④層析：采用陰離子交換法進行層析，回收目的蛋白酶液；

⑤透析：將目的蛋白酶液加入到透析袋中，用貯存緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液，透析后加入等體積甘油，即得純化的Taq DNA聚合酶酶液，于-20℃以下貯存；

其中，所述貯存緩沖液的配方為：40mM Tris-HCl，100mM KCl，0.2mM EDTA，2mM二硫蘇糖醇，1％吐溫20，1％Nonidet P40，pH＝8.0；

(4)抗體修飾：

將純化的Taq DNA聚合酶酶液與抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體混合孵育，即得熱啟動Taq DNA聚合酶；

步驟(3)中三步鹽析法具體如下：

第一步鹽析：向熱變性得到的上清中加入終濃度15％的硫酸銨，冰浴鹽析1小時，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心15-20min，收集上清，將上清轉移到透析袋中，用透析緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液；

第二步鹽析：向透析后的溶液中再次加入終濃度15％的硫酸銨，冰浴鹽析1小時，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心15-20min，收集上清，將上清加入到透析袋中，用透析緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液；

第三步鹽析：向兩次鹽析透析后的溶液中加入終濃度25％的硫酸銨，冰浴鹽析1小時，然后2-8℃，12000rpm-14000rpm離心15-20min，收集沉淀，將沉淀用懸浮緩沖液溶解，得到粗酶液；將粗酶液加入到透析袋中，用透析緩沖液于4℃透析24小時，期間更換兩次透析液；

其中，所述透析緩沖液的配方為：20mM Tris-HClpH＝8.0；

第三步鹽析中用于溶解沉淀的懸浮緩沖液的配方為：20mM Tris-HCl，50mM葡萄糖，1mMEDTA，pH＝8.0；

步驟(3)中層析的具體操作如下：先用平衡緩沖液平衡色譜柱5個色譜柱柱體積，取0.45μm濾膜過濾后的粗酶液上樣，上樣后先用5個色譜柱柱體積的平衡緩沖液沖洗色譜柱，然后用5個色譜柱柱體積的濃度40％的洗脫緩沖液洗脫色譜柱，最后用5個色譜柱柱體積的濃度60％的洗脫緩沖液洗脫色譜柱，回收目的蛋白酶液；

其中，所述平衡緩沖液的配方為：20mM Tris-HClpH＝8.0；

所述洗脫緩沖液的配方為：20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0；

步驟(4)具體如下：

⑥將純化的Taq DNA聚合酶酶液用酶稀釋液稀釋，將0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液與1mg/ml抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體按體積比2:1混合孵育；

⑦向上述混合體系中加入與0.5mg/ml Taq DNA聚合酶酶液等體積的酶稀釋液，即得熱啟動Taq DNA聚合酶，于-20℃以下貯存；

所述酶稀釋液的配方為：20mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM二硫蘇糖醇，0.5％吐溫20，0.5％Nonidet P40，50％甘油，pH＝8.0；

步驟(4)將Taq DNA聚合酶酶液與抗Taq DNA聚合酶單克隆抗體于25℃孵育30min。