[發明專利]基于核酸適配體的微囊藻毒素LR的微懸臂梁陣列檢測方法

在審

• 申請號: 201711223147.7
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN108181459A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 張青川;張廣平;吳尚犬;李潮;伍小平
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/558
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 單驍越

本發明提供一種用于檢測樣品溶液中的微囊藻毒素LR的方法，所述方法包括以下步驟：將能夠特異性結合微囊藻毒素LR的核酸適配體固定在微懸臂梁陣列上；使固定有所述核酸適配體的微懸臂梁陣列與樣品溶液接觸；檢測固定有所述核酸適配體的微懸臂梁陣列在與所述樣品溶液接觸后產生的彎曲變形。本發明還提供用于檢測樣品溶液中的微囊藻毒素LR的微懸臂梁陣列和系統。

技術領域

本發明涉及水體環境污染檢測領域，特別是涉及一種基于表面應力效應微懸臂梁陣列傳感器，使用適配體作為探針分子檢測微囊藻毒素LR的方法。

背景技術

微囊藻毒素(microcystin，MC)是一類主要由藍藻產生的具有生物活性的環狀七肽化合物，這種化合物在水體富營養化導致水華時可由藍藻細胞大量產生，當藻細胞衰老、死亡和破裂時，MC會被釋放到水體中。人體直接接觸含有毒素的水，可引起過敏和急性胃腸炎。MC是一種強烈的肝毒素，它能夠強烈抑制蛋白磷酸酶活性，可以導致肝臟損傷出血和壞死。MC還是一種潛在的腫瘤促進劑，長期飲用含微量微囊藻毒素的水源會引起肝癌等疾病。動物通過接觸或飲用含有MC的水會出現腹瀉、嘔吐、呼吸急促等癥狀，甚至死亡。MC可通過食物鏈富集，而且還表現出遺傳毒性。它對水體環境和人類健康的危害已成為全球關注的重大環境問題之一。世界衛生組織提出的飲用水中MC含量的允許標準為1ug/L。迄今已經發現了超過80種MC，其中微囊藻毒素LR(MC-LR)是最常見、毒性最強一種。

目前已有多種檢測MC-LR的方法，常用的檢測方法有生物檢測法，高效液相色譜法，酶聯免疫檢測和蛋白磷酸酶抑制試驗等方法。但這些方法各有缺點，如生物檢測法需要具備一定的實驗條件和專業知識才能進行，該方法實驗周期長、靈敏度低、容易出現假陽性；液相色譜法檢測靈敏度高，但是所用儀器昂貴，需專業操作知識才能使用，樣品需要復雜的預處理過程；酶聯免疫檢測方法和蛋白磷酸酶抑制試驗方法靈敏度高，但都不能分辨MC異構體。因此發展無標記、快速、靈敏度高、經濟高效的MC-LR檢測方法是很有必要的，對水體環境安全領域具有重要意義。

基于表面應力效應的微懸臂梁(簡稱微梁)傳感技術是在原子力顯微鏡的基礎上發展起來的一種技術。在實驗中，探針分子被修飾在微懸臂梁的表面。當目標分子與探針分子在微懸臂梁表面發生生物或者化學反應時，其表面應力會發生變化，從而導致微懸臂梁發生彎曲變形。通過光學或者電學方法檢測這種彎曲變形，可以得到反應的信息。相比于傳統的傳感技術，微梁傳感技術不需要分子標記，靈敏度高，響應快速，可以實時監測實驗的全過程。

核酸適配體是一段具有分子識別能力的DNA或者RNA的序列，通常可以通過指數富集的配體系統進化技術(SELEX)從核酸分子庫中篩選得到。其分子識別模式與抗體非常相似，能夠與特定的分子結合，并且具有很高的親和性和特異性。適配體由體外方法獲得，可以結合相比于抗體更多的靶標分子，如劇毒的分子等。適配體通過化學合成和純化，在合成過程中可以修飾需要的化學基團，化學穩定性遠優于抗體，活性均一，受環境因素影響小，易存儲，價格便宜，同時靈敏度也極高，是檢測小分子的理想探針分子。適配體與靶目標結合時產生強烈構象變化，空間變形明顯，能夠與微梁傳感器結合使用。

在MC-LR檢測領域，懸臂梁傳感技術在動態模式下使用其對應的抗體已有研究報道，但是尚未有使用適配體作為探針分子在基于應力模式下微梁傳感平臺進行檢測的報道。

發明內容

在本發明中，發明人提出使用修飾有DNA適配體的微懸臂梁陣列對MC-LR進行檢測，取得了很高的靈敏度，還能夠將MC-LR從不同的異構體中區分出來，表現出極強的特異性，并且可以在實際樣品自來水中進行有效檢測。

本發明提供了一種基于核酸適配體的微懸臂梁陣列傳感器，可以對微囊藻毒素LR進行實時定量檢測，有很高的靈敏度和特異性，并且能夠對實際樣品進行檢測，滿足國家對水體中微囊藻毒素LR檢測的標準。