[發明專利]一種萃仙菇雜交育種方法

在審

• 申請號: 201711221929.7
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107896821A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 劉克東;劉振濤;于秀英;楊晶;閆衛榮;單書凱
• 申請（專利權）人: 濟南蓬生農業科技有限公司
• 主分類號: A01G18/00
• 分類號: A01G18/00;A01G18/40;A01G18/50;A01H1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種萃仙菇雜交育種方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）將白玉菇菌株與灰蟹菇菌株分別培養得到對應的適齡菌絲；

（2）原生質體的制備與再生：無菌條件下，將步驟（1）所得適齡菌絲分別進行溶壁酶酶解處理，得到原生質體，純化，加入原生質體再生培養液，封口培養；

（3）挑取再生原生質體的尖端菌絲進行培養，并在無菌條件下篩選單核再生菌株，然后將白玉菇單核菌株與灰蟹菇單核菌株配對雜交，接種培養，純化，即得。

2.根據權利要求1所述的一種萃仙菇雜交育種方法，其特征在于，步驟（1）的培養方法為：先接種至試管斜面PDA培養基，25℃恒溫培養10天，然后轉接到平板PDA培養基，25℃恒溫培養5～7天，再轉接到250mL三角瓶液體加富培養基中，25℃恒溫搖床上震蕩培養4天，最后用無菌槍頭吸取5mL新鮮幼嫩培養液到另一個250mL三角瓶液體加富培養基中，25℃恒溫培養4天。

3.根據權利要求1所述的一種萃仙菇雜交育種方法，其特征在于，步驟（2）中，溶壁酶酶解處理的具體方法是：無菌條件下，將適齡菌絲倒入離心管中，離心處理，洗滌；用無菌濾紙吸干菌絲水分，然后取菌絲置于另一離心管中，加入溶壁酶溶液，30℃水浴，脫壁2.5小時。

4.根據權利要求1所述的一種萃仙菇雜交育種方法，其特征在于，步驟（2）中，純化方法是：原生質體離心，除去上清酶液，再次離心，穩滲劑溶液洗滌，第三次離心去除穩滲劑與酶液，采用原生質體再生培養液洗滌，吸除上清液。

5.根據權利要求1所述的一種萃仙菇雜交育種方法，其特征在于，步驟（2）中，加入原生質體再生培養液 5mL，顛倒數次后混勻，靜置1小時，待菌絲沉淀后，取上清液到離心管中，加入原生質體再生培養液 5mL，稀釋后鏡檢，當原生質體的含量調整至每個低倍鏡視野下只有1～2個原生質體的濃度時，吸取100μL的原生質體懸浮液涂布于原生質體再生培養基平板中，封口膜封口后，25℃恒溫培養8～12天。

6.根據權利要求1所述的一種萃仙菇雜交育種方法，其特征在于，步驟（3）的具體方法如下：

（31）觀察原生質體再生的萌發情況，當出現芒狀再生菌落的時候，挑取再生原生質體的尖端菌絲至試管斜面PDA培養基中進行培養；

（32）在無菌條件下，吸取5～10μL的乳酸石炭酸棉藍染色液于載玻片上，挑取步驟（31）中培養好的菌絲置于所述染色液中，蓋上蓋玻片，染色1分鐘，橡膠塞壓平，制片在顯微鏡下鏡檢，以是否存在鎖狀聯合為單核再生菌株的篩選標準；

（33）無菌條件下，將白玉菇單核菌株與灰蟹菇單核菌株配對雜交，挑取其單核菌株菌塊接種到試管斜面PDA培養基上，兩菌塊間間隔距離為1cm，25℃恒溫培養；

（34）當兩菌絲交聯在一起時，挑取交聯的菌絲于載玻片的乳酸石炭酸棉藍染色液中，蓋上蓋玻片，染色1分鐘，橡膠塞壓平，在顯微鏡視野下鏡檢，以是否存在鎖狀聯合為判斷標準；若發現有鎖狀聯合的菌株，挑取交聯菌絲轉接到試管斜面PDA培養基中，25℃恒溫培養，即得純化的雜交菌株；

（35）雜交菌株驗證：進行拮抗反應實驗和出菇試驗驗證雜交種與親本菌株的形狀差異。