[發(fā)明專利]一種敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711221647.7
• 申請(qǐng)日: 2017-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN109837305A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾瀅;張長(zhǎng)風(fēng);吳詠東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳賓德生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N7/01;C12N15/113;C12N5/10;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強(qiáng)

本發(fā)明提供了一種敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括：將嵌合抗原受體CAR?CD22的編碼基因與載體相連，進(jìn)行重組慢病毒的構(gòu)建，并轉(zhuǎn)染CD3陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后的T細(xì)胞的PD1基因進(jìn)行敲除，得到敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受體T細(xì)胞。所述靶向CD22嵌合抗原受體T細(xì)胞敲除了PD1基因，有利于T細(xì)胞在患者體內(nèi)的擴(kuò)增，避免腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，具有高效且特異性的殺傷CD22陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的性能，持久地維持細(xì)胞的活力和殺傷力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，特別涉及一種敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

CAR-T(嵌合抗原受體T細(xì)胞)技術(shù)是一種新型細(xì)胞療法，它是將經(jīng)過(guò)CA R改造的T細(xì)胞回輸至人體，激活自身免疫系統(tǒng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治療上有著顯著的療效，被認(rèn)為是目前最有效的惡性腫瘤的治療方式之一。

目前CAR-T技術(shù)在CD19陽(yáng)性血液瘤(如B細(xì)胞淋巴瘤、急慢性B淋巴細(xì)胞白血病)中取得了令人矚目的效果。但由于同類的腫瘤常表達(dá)各不相同的免疫表型，舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)CD19陰性逃逸，即，存在不表達(dá)CD19的腫瘤細(xì)胞，則CD19靶點(diǎn)失效，而CART-CD19無(wú)法再發(fā)揮抗腫瘤效果。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫檢查點(diǎn)抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在機(jī)體免疫中通過(guò)阻止T細(xì)胞激活來(lái)負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以防止自身免疫疾病并保證自體耐受。在腫瘤微環(huán)境中，PD1會(huì)抑制殺傷性T細(xì)胞的活性，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視。因此，有必要提供能靶向惡性腫瘤的其他廣泛表達(dá)靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞且可避免腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受體T細(xì)胞，所述靶向CD22嵌合抗原受體T細(xì)胞敲除了PD1基因，有利于T細(xì)胞在患者體內(nèi)的擴(kuò)增，避免腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，具有高效且特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞的性能，更好的維持細(xì)胞的活力和殺傷力。

第一方面，本發(fā)明提供了一種敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括：

(1)提供靶向CD22的嵌合抗原受體CAR-CD22的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號(hào)肽的編碼基因、靶向CD22的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區(qū)的編碼基因、跨膜區(qū)的編碼基因、胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的編碼基因，其中，所述靶向CD22的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-CD22的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPX LD-CAR-CD22重組質(zhì)粒；

(3)包裝所述pWPXLD-CAR-CD22重組質(zhì)粒，得到重組慢病毒；

(4)將所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染CD3陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞，獲得嵌合抗原受體T細(xì)胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受體T細(xì)胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向CD22的嵌合抗原受體T細(xì)胞。

可選的，所述靶向CD22的單鏈抗體的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

可選的，所述靶向CD22的單鏈抗體的氨基酸序列的編碼基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

可選的，所述靶向CD22的單鏈抗體的氨基酸序列的編碼基因應(yīng)該考慮簡(jiǎn)并堿基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的編碼基因包括如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，保護(hù)范圍還應(yīng)該保護(hù)與SEQ ID NO:5具有堿基簡(jiǎn)并性質(zhì)的核苷酸序列，這些核苷酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列仍然為SEQ ID NO:1。