[發(fā)明專利]一種組合二硫鍵的耐熱突變脂肪酶及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711220203.1
• 申請日: 2017-11-29
• 公開（公告）號: CN107858338B
• 公開（公告）日: 2020-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 管武太;李力浪;吳煒坤;鄧子瀟
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/70
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 劉瑜;蘇運(yùn)貞

本發(fā)明公開了一種組合二硫鍵的耐熱突變脂肪酶及其制備方法與應(yīng)用。該脂肪酶為氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的2N突變脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的2S突變脂肪酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的3N突變脂肪酶和氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的3S突變脂肪酶。本發(fā)明是以S8?214脂肪酶為親本，在與二硫鍵S8?214所在的1個(gè)或2個(gè)不同區(qū)域中/區(qū)域間引入1對效果提升較弱的二硫鍵，或在與二硫鍵S8?214所在的相同區(qū)域中同時(shí)引入1對或2對效果提升較強(qiáng)的二硫鍵，實(shí)現(xiàn)二硫鍵突變的組合優(yōu)化；其中，在不同區(qū)域中/間組合二硫鍵效果更優(yōu)。獲得的突變脂肪酶的熱穩(wěn)定性強(qiáng)，特別適合在工業(yè)上應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，特別涉及一種組合二硫鍵的耐熱突變脂肪酶及其 制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

耶氏解脂酵母脂肪酶2(Lip2)是一種優(yōu)良的脂肪酶，對中長鏈脂肪酸甘油 三酯(C12～C16)具有較高催化活性，被廣泛應(yīng)用于油脂水解、污水處理、食品 加工、生物能源、化學(xué)合成以及胰腺缺乏癥的治療等多個(gè)領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣泛。 但該脂肪酶在高溫下迅速失活，在工業(yè)生產(chǎn)中損失較大，因此改善其熱穩(wěn)定性 對拓寬其實(shí)際應(yīng)用具有十分重要的意義。

二硫鍵是蛋白質(zhì)中唯一的共價(jià)鍵，約需要209.3～418.6kJ/mol的能量才能將 其打斷，對維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有關(guān)鍵的作用。二硫鍵增強(qiáng)蛋白質(zhì)的結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定性表現(xiàn)在減少其構(gòu)象熵，及增加其解折疊自由能，提高熱力學(xué)穩(wěn)定性。 同時(shí)，其效應(yīng)還與提高蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性有關(guān)。二硫鍵能使肽鏈不同區(qū)域 的氨基酸殘基聚集靠攏，形成高密度的氨基酸殘基穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。當(dāng)圍繞二硫鍵的 殘基為疏水氨基酸時(shí)，則形成局部的疏水中心，減少水分子的進(jìn)入，防止氫鍵 被破壞，保持高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。在蛋白質(zhì)中構(gòu)建二硫鍵是提高其穩(wěn)定性的主要 策略之一，已經(jīng)成功地應(yīng)用于多種脂肪酶，如圓弧青霉低溫脂肪酶，南極假絲 酵母脂肪酶和華根霉脂肪酶等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已篩選出能提高Lip2耐熱性 能的單對二硫鍵突變位點(diǎn)，S2-210、S8-214、S14-216、S60-69、S122-196和 S118-177。

二硫鍵的正確形成是蛋白質(zhì)折疊的限速步驟之一，控制引入的二硫鍵數(shù)目 非常必要。因此，在引入一定數(shù)目的二硫鍵時(shí)，合理地進(jìn)行組合才能最大限度 地提高酶分子的熱穩(wěn)定性能，但目前并欠缺對二硫鍵組合方式和組合效果的探 討。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，有針對性地進(jìn)行了二 硫鍵突變的組合優(yōu)化，并提供4種組合二硫鍵的耐熱突變脂肪酶。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述組合二硫鍵的耐熱突變脂肪酶的制備方 法。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述組合二硫鍵的耐熱突變脂肪酶的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種組合二硫鍵的耐熱突變脂肪酶， 是以S8-214脂肪酶為親本，在與二硫鍵S8-214所在的1個(gè)或2個(gè)不同區(qū)域中/區(qū)域 間引入1對效果提升較弱的二硫鍵，或在與二硫鍵S8-214所在的相同區(qū)域中同時(shí) 引入1對或2對效果提升較強(qiáng)的二硫鍵；

所述的S8-214脂肪酶為耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2二硫鍵突變體S8-214，具 體為：在耶氏解脂假絲酵母脂肪酶2的解折疊和濕熔球態(tài)形成的關(guān)鍵區(qū)域(耶氏 解脂假絲酵母脂肪酶2的第180位～280位氨基酸序列)引入二硫鍵突變，其制備 方法參考中國專利申請201610279266.3“一種熱穩(wěn)定的脂肪酶及制備方法與應(yīng) 用”。

所述的區(qū)域?yàn)棣抡郫B頭部區(qū)域，蓋子1區(qū)域和β折疊尾部區(qū)域；其中，所述的 β折疊頭部區(qū)域?yàn)镾8-214脂肪酶的第32位到第82位氨基酸序列；所述的蓋子1區(qū)域 為S8-214脂肪酶的第83位到第136位氨基酸序列；所述的β折疊尾部區(qū)域?yàn)镾8-214 脂肪酶的第1位到第11位氨基酸及第180位到第280位氨基酸；