[發明專利]一種提高表達文庫陽性率的建庫方法

在審

• 申請號: 201711220100.5
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN109837594A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 王樹偉;趙仕蘭
• 申請（專利權）人: 上海歐易生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種能夠提高表達文庫陽性率的文庫構建方案。它通過在mRNA反轉錄5’引物序列中添加不同數量的A實現一個mRNA具有三種讀碼框，保證其中一種可進行正確翻譯的反轉錄方案。此方案獲得的cDNA無論后續進行酵母文庫構建還是連接到蛋白表達載體上，均可提高mRNA正確表達蛋白的陽性率，更真實的反應樣本的實際狀態。

技術領域

本發明涉及一種新的表達文庫構建方法，該方法尤其可以提高此類文庫的陽性率，更真實的反應樣本的狀態。

背景技術

目前，常用的文庫構建方式是先將mRNA利用反轉錄引物通過反轉錄酶的作用將RNA反轉錄生成cDNA一鏈和RNA的雜合產物，同時由于反轉錄酶的作用會在mRNA的5’末端加上一段引物用于后續的擴增或者酶切，再通過二鏈合成得到一條cDNA雙鏈。將得到的兩端都有特異引物的cDNA雙鏈產物通過TA克隆連接到T載體上，大腸桿菌轉化并過夜培養后隨機挑取部分單菌落利用一代測序對連入T載體的cDNA進行測序確認cDNA符合實驗要求，再將最初得到的cDNA雙鏈與特定的質粒共轉酵母菌并涂板培養，得到酵母文庫；也可以將cDNA連入其它表達載體，得到其它種類的表達文庫。雖然該方法是廣泛應用的建庫方案，但是此種文庫存在一種缺陷：由于在反轉錄時只使用一種5’端引物，而常用的載體讀碼框也只有一種，因此導致每一條mRNA 也只有一種讀碼框。由于從mRNA到蛋白質的翻譯過程中，三個堿基編碼一個氨基酸，從起始密碼子開始，到終止密碼子結束，任何非3的倍數的堿基的丟失或插入都會導致移碼突變，同樣，如果連接進去的cDNA序列與載體讀碼框不一致，在蛋白表達過程中也會導致移碼突變，使cDNA不能正確表達，從而降低了表達文庫的陽性率，使所得到的實驗結果不能反應樣本的真實情況。

發明內容

為了降低現有文庫制備方案對實驗結果的影響，使文庫能更真實的反應樣本的實際情況，本發明提供一種新的建庫方案，此方案改變了cDNA合成時的5’端引物序列，增加了cDNA 反轉錄時5’引物的種類，從原來的一種增加到三種，從而使后續建成的表達文庫的讀碼框存在三種可能，無論cDNA從哪個堿基開始被翻譯，都能保證其存在一種正確的讀碼框。可使結果能更真實的反應樣本的實際情況。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：在總RNA進行反轉錄時使用3種5’端引物，對同一條RNA而言，每一種5’端引物代表一種讀碼方式。所使用的5’引物序列分別是：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’，

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCAGGG-3’，

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCAAGGG-3’。

采用該方案進行實驗時所需起始RNA的量是原來用量的3倍，例如原實驗方案只需1份總 RNA，那么在本實驗方案中則需要反轉錄3份相同量的cDNA，每份樣本作為一個樣本分別使用’不同的反轉錄引物獨立進行cDNA的一鏈和二鏈合成，得到cDNA雙鏈之后，把3份雙鏈cDNA等量混合后采用T克隆進行文庫的測序實驗。測序結果如果符合預期，則此三份cDNA的混合樣本可以用于后續的文庫構建實驗。此種方案得到的cDNA能保證每一個mRNA來源的cDNA都具有三種讀碼框，連接到載體上之后，讀碼框正確的一種能夠被表達。

本發明的有益效果是，可以提高表達文庫的陽性率，有效避免了文庫數據的損失，更接近真實的反應樣本的實際狀況。

附圖說明

下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。

圖1是反轉錄時所使用的5’端引物序列：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’，