[發(fā)明專利]荷花體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生用培養(yǎng)基及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711210241.9
• 申請(qǐng)日: 2016-06-21
• 公開（公告）號(hào): CN107691226B
• 公開（公告）日: 2019-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方林川;李紹華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院林業(yè)果樹科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 北京精金石知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11470
• 代理人: 強(qiáng)紅剛

本發(fā)明提供了一種荷花體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生用培養(yǎng)基及其應(yīng)用。該培養(yǎng)基包括胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基和胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法是將外植體放入胚性愈傷誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)出愈傷組織并進(jìn)行增殖培養(yǎng)；將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到胚狀體發(fā)生培養(yǎng)基中，發(fā)育形成胚狀體；將產(chǎn)生的胚狀體移入胚萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行萌發(fā)，發(fā)育形成子葉形胚；將萌發(fā)的子葉形胚移至含荷花成苗培養(yǎng)基中成苗培養(yǎng)，然后移栽至自然環(huán)境中。通過本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)，一個(gè)外植體能分化出一塊胚性愈傷團(tuán)，從中能高效分化1000個(gè)以上的體細(xì)胞胚并最終萌發(fā)，既能促進(jìn)荷花的轉(zhuǎn)基因發(fā)展，又可以為荷花的栽培應(yīng)用提供大量的種苗。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及植物的組織培養(yǎng)體系，尤其涉及一種荷花體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生用培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

荷花(NelumbonuciferaGaertn.)為蓮科蓮屬多年生水生花卉，是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，具有很高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和獨(dú)特的文化內(nèi)涵，深受人們喜愛。根據(jù)其用途，可分為藕蓮、籽蓮與花蓮。

2013年，荷花品種--中國(guó)古代蓮的全基因組測(cè)序完成，為荷花的基因功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。然而，作為轉(zhuǎn)基因重要技術(shù)基礎(chǔ)的荷花遺傳轉(zhuǎn)化再生體系尚不成熟，嚴(yán)重制約了荷花轉(zhuǎn)基因工作的開展。盡管以荷花為研究對(duì)象的組織培養(yǎng)技術(shù)有研究并成功獲得植株再生的報(bào)道，但它的的組織培養(yǎng)不能象其它作物容易誘導(dǎo)再生(如小麥、水稻、玉米等形成胚性愈傷后多次繼代增殖與保存，并誘導(dǎo)高效分化和再生植株)，因此一直被認(rèn)為是難以進(jìn)行培養(yǎng)的園藝作物，限制了荷花組織培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)在育種領(lǐng)域的應(yīng)用。

一般來(lái)說(shuō)，植株再生的途徑可分為兩種，一種途徑是由莖尖直接分化形成叢生苗，然后進(jìn)行增殖，最后誘導(dǎo)生根獲得完整植株，即器官發(fā)生途徑。器官發(fā)生途徑的優(yōu)點(diǎn)在于誘導(dǎo)過程相對(duì)簡(jiǎn)單，但它的缺點(diǎn)在于增殖系數(shù)低，同時(shí)，此種再生途徑被認(rèn)為是多細(xì)胞起源，易形成嵌合體，導(dǎo)致假陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的出現(xiàn)，因此在轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用上受很大的限制。對(duì)荷花來(lái)說(shuō)，目前此途徑主要依靠荷花成熟胚在試管中離體培養(yǎng)出無(wú)菌苗，再用無(wú)菌苗的莖尖作為外植體誘導(dǎo)出愈傷，然后對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化，最后生根成苗。關(guān)于用荷花成熟胚進(jìn)行無(wú)菌苗培養(yǎng)時(shí)取荷花種胚的方法以及消毒的方法，郭娜娜等(荷花成熟胚的組織培養(yǎng)[J].河南科學(xué),2013(3):281-284.)使用濃硫酸腐蝕蓮子種皮，用小刀破殼后直接用酒精和氯化汞消毒后成熟胚的離體成活率達(dá)到86.63％，最終可以形成無(wú)菌苗。

另一種途徑則是通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，即先通過誘導(dǎo)外植體形成胚性愈傷，進(jìn)一步誘導(dǎo)胚性愈傷發(fā)育成成熟的胚狀體并萌發(fā)成完整植株，此過程類似于植物的有性繁殖，體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的困難在于，胚性愈傷與胚狀體的誘導(dǎo)與增殖周期長(zhǎng)，獲得難度大且有基因型的差異，但因?yàn)樗谝韵路矫娴膸讉€(gè)特點(diǎn)使這項(xiàng)技術(shù)極具吸引力：一、一旦成功誘導(dǎo)出胚性愈傷，它可以獲得幾百倍甚至上千倍的增殖系數(shù)；二，胚性愈傷可以長(zhǎng)期保持；三、體細(xì)胞胚被認(rèn)為是單細(xì)胞起源，在遺傳轉(zhuǎn)化過程中不易形成嵌合體導(dǎo)致假陽(yáng)性的發(fā)生，因此是轉(zhuǎn)基因的良好受體。在荷花上，目前尚未見體細(xì)胞胚胎再生途徑方面的報(bào)道。

現(xiàn)有技術(shù)中荷花作為商業(yè)開發(fā)時(shí)，利用種藕進(jìn)行人工繁育的繁殖系數(shù)低、成本高；同時(shí)在基礎(chǔ)研究中缺乏高效的再生體系，限制了基因工程育種工作的開展；這些因素不利于荷花的經(jīng)濟(jì)栽培與遺傳育種工作。因此，通過研究獲得一種荷花的高效再生體系，以解決荷花人工胚狀體的獲取、基因工程育種等問題，并實(shí)現(xiàn)荷花的人工快速離體培養(yǎng)與再生，這顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種荷花的未成熟子葉體細(xì)胞胚誘導(dǎo)、增殖、分化、萌發(fā)與成苗方法，以實(shí)現(xiàn)荷花的快速經(jīng)濟(jì)繁育，極大提高荷花的繁育系數(shù)，同時(shí)本發(fā)明得到的再生體系可以為荷花的基因工程育種提供良好的材料基礎(chǔ)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究并不懈探索，最終獲得了一種荷花未成熟子葉體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑的再生方法，該方法包括利用外植體誘導(dǎo)進(jìn)行組織培養(yǎng)的步驟，所采用的外植體為荷花合子胚中的未成熟子葉。