[發明專利]一種腫節風SCAR分子鑒定標記的克隆與驗證方法

在審

• 申請號: 201711209598.5
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN107881223A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 朱丹;羅育;王德寶
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學;廣西柏朗健康產業發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6806
• 代理公司: 南寧市來來專利代理事務所(普通合伙)45118
• 代理人: 來光業

技術領域

本發明涉及中藥鑒別技術領域，具體是一種腫節風SCAR分子鑒定標記的克隆與驗證方法。

背景技術

腫節風（又名草珊瑚、九節茶、接骨木、接骨金粟蘭、九接風等）為常用中藥，系金粟蘭科（Chloranthaceae）草珊瑚屬植物草珊瑚（Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai）的全草。2010版《中華人民共和國藥典》收載其作為法定藥材，同時以腫節風為原料的腫節風片、血康口服液、萬通炎康片及提取物腫節風浸膏也已收入 2010 版藥典，腫節風注射液、新癀片、消炎片、三蛇膽川貝液均收入部頒藥品標準中。

腫節風作為我國傳統的中藥材，歷來受到廣泛的關注和研究，對腫節風的相關研究主要集中在化學成分、藥理活性和臨床應用等方面。研究表明，腫節風具有抗菌、抗輻射、抗腫瘤、促進骨折愈合及鎮痛等多種活性，且腫節風及其提取物具有較好的安全性，急性毒性試驗結果屬實際無毒，動物精子畸形試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗，未發現致突變。近年來發現，腫節風可用于治療腫瘤（胰腺癌、胃癌、直腸癌、肝癌、食道癌等），且有較顯著效果。

作為重要的傳統中藥，市場上已出現了金粟蘭、雞爪蘭、及己等與腫節風功效不盡相同的非藥典收載的混淆品，嚴重影響著腫節風的臨床應用，造成了用藥安全問題。目前，對中藥材鑒定的方法主要有性狀鑒別、顯微鑒別和理化鑒別，雖國內外已報道應用中藥分子鑒定方法從基因分子水平對中藥材進行鑒定，如中國專利201510515936.2鑒別草珊瑚與3 種混淆品的分子特異性標記引物及方法，通過對草珊瑚、金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己的 trnL-F 區序列進行測序，分析其序列結構和特征，尋找單核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphism SNP) 分子標記，設計分別識別草珊瑚，金粟蘭，寬葉金粟蘭和及己的特異識別引物，建立多重PCR 技術，可快速簡單鑒別草珊瑚與金粟蘭、寬葉金粟蘭和及己3 種混淆品的方法。但此方法較適用于干燥及加工后的產品鑒定，且提取的DNA不夠完整，鑒別的范圍較窄。

SCAR（Sequence characterized amplified region，特征性擴增片段區域）分子標記是研究對象基因組中特定序列的DNA分子，找到SCAR分子標記，并獲得它的序列，就可以根據序列設計特異性引物，對研究對象實現特異性PCR分子鑒定方法。但藥用植物因其自身次生代謝物較復雜，提取基因組DNA相對較為困難，若其中的次生代謝物不能有效去除，必將會影響到后續的PCR擴增。

發明內容

基于此，本發明提供了一種腫節風SCAR分子鑒定標記的克隆與驗證方法，目的是尋找簡單、可重復的分子鑒定方法對傳統中藥腫節風進行鑒定，以期區分其混淆品，保證用藥安全。

一種腫節風SCAR分子鑒定標記的克隆與驗證方法，方法包括以下內容

1、采用改良CTAB法提取腫節風基因組DNA，具體包括以下步驟：

（1）稱取腫節風細嫩葉片0.5 g，剪碎放入預冷研缽中，液氮條件下研磨成均勻細粉狀迅速轉移至15 mL離心管；

（2）加入65 ℃預熱的1.5×CTAB提取緩沖液及β-巰基乙醇，上下顛倒混勻后，65 ℃水浴30 min，每10min取出搖勻一次，冷卻至室溫，12000 r/min離心10 min；

（3）吸取上清，加入等體積氯仿/異戊醇（24：1），輕緩上下顛倒混勻，12000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，加1/l0體積1×CTAB提取緩沖液和等體積的氯仿/異戊醇(24：1)，輕緩上下顛倒混勻，12000 r/min離心10 min；

（4）小心吸取上清液，加入等體積1×CTAB沉淀緩沖液，輕緩搖勻，65 ℃水浴30 min，12000 r/min離心10 min，棄上清液，加1 mol/LNaC1溶解沉淀，12000 r/min離心10 min，吸取上清液轉移至1.5 mL EP管，加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，輕緩搖勻，可見白色絮狀物聚集，-20 ℃靜置15 min，12000 r/min離心5 min，小心倒掉上清液，70％乙醇漂洗沉淀，12000 r/min離心10 min，棄上清液，自然風干后加三蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存。

2、基因組DNA質量檢測