[發明專利]一種基于肽類樹形分子修飾熒光碳點的腫瘤微環境響應納米粒及其制備方法

有效

• 申請號: 201711207756.3
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN107802840B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 顧忠偉;馬瑾;易強英;康珂
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: A61K47/42
• 分類號: A61K47/42;A61K47/32;A61K47/04;A61K45/00;A61P35/00;C08F120/34;A61K31/704
• 代理公司: 成都正華專利代理事務所(普通合伙) 51229
• 代理人: 李蕊

1.一種基于肽類樹形分子修飾熒光碳點的腫瘤微環境響應納米粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)納米熒光碳點的制備

將葡萄糖溶于水中，制成質量濃度為3-5g/mL的葡萄糖水溶液，加入PEG200，攪拌均勻后置于微波爐中，于800W條件下微波加熱3-5min，冷卻至室溫，用水稀釋，透析過夜，再過0.45μm濾膜，用去離子水稀釋，得到濃度為2.5-3.5g/mL的納米熒光碳點溶液；其中葡萄糖溶液和PEG200的體積比為2-5:8-20；

(2)熒光碳點表面巰基化修飾

將納米熒光碳點溶液、EDC、和NHS混合，攪拌活化30-40min，接著加入胱胺避光反應過夜，反應結束后，將所得溶液透析24h，每4h換一次透析液，收集透析后的溶液，加入DTT攪拌過夜，將反應所得液再次透析48h，每4h換一次透析液，收集透析液，冷凍干燥后得巰基化的納米熒光碳點；其中納米熒光碳點、EDC、NHS、胱胺和DTT的摩爾比為8-10:1.8-2.2:1.8-2.2:0.8-1.2:3-7；

(3)精氨酸-賴氨酸接枝的二代肽類樹狀分子的制備

將甲酯保護的賴氨酸、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、EDC·HCl和HOBT加入反應容器中，抽真空-氮氣循環三次，然后加入二氯甲烷攪拌溶解，接著在冰浴條件下加入DIEA，在室溫下反應24h，收集反應溶液，旋蒸除去溶劑，并加入氯仿溶解產物，再依次用HCl、NaOH水溶液和飽和NaCl溶液洗滌，收集有機相，加入無水硫酸鎂，干燥，旋蒸濃縮，純化，得甲酯和N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)保護的肽類二代樹狀分子；其中甲酯保護的賴氨酸、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、EDC·HCl、HOBT和DIEA的摩爾比為1:2-3:2-3:2-3:6-9；

脫甲酯保護：將上述產物溶解于NaOH/MeOH溶液中，室溫下攪拌反應6-7h，旋蒸除去混合物中的MeOH，加入CHCl₃溶解殘余物，在攪拌狀態下滴加HCl調節溶液pH值至2-3，收集有機相，加入無水硫酸鎂，干燥過夜，過濾后旋蒸除去溶劑，減壓濃縮后得脫甲酯后的二代樹狀分子；

連接胱胺：將脫甲酯后的二代樹狀分子、胱胺、HBTu和HOBT置于反應容器中，抽真空-氮氣循環三次，在氮氣狀態下加入二氯甲烷攪拌溶解，在冰浴條件下加入DIEA，在室溫下反應20-24h，收集反應溶液，旋蒸除去溶劑，并加入氯仿溶解產物，然后依次用HCl、NaOH水溶液和飽和NaCl溶液洗滌，收集有機相，加入無水硫酸鎂，干燥過夜，旋蒸濃縮出固體產物；其中脫甲酯后的二代樹狀分子，胱胺，HBTu，HOBT，DIEA的摩爾比為2-3:1-1.5:2-4:2-4:6-9；

脫保護：取上述產物置于反應容器中，抽真空-氮氣循環三次，在氮氣狀態下加入二氯甲烷攪拌溶解，在冰浴條件下加入三氟乙酸，之后在室溫下攪拌反應6-8h，減壓除去溶劑及三氟乙酸，得到的產物在冰無水乙醚中沉淀，干燥后得脫保護后的精氨酸-賴氨酸接枝的二代肽類樹狀分子；

(4)熒光碳點表面修飾二代肽類樹狀分子

將巰基化的納米熒光碳點和步驟(3)所得物混合，加入0.01M，pH＝8的硼酸緩沖液溶解，封口后在室溫下反應4-6h，收集反應液，透析48h，再過0.45μm濾膜，收集濾液，冷凍干燥得到產物；其中巰基化的納米熒光碳點和步驟(3)所得物的質量比為1:1.5-2.5；

(5)兩性離子聚合物聚羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯的制備

以羧酸甜菜堿甲基丙烯酸酯作為反應單體，2-溴代異丁酸乙酯為引發劑，1,1,4,7,10,10-六甲基三亞乙基四胺為配體，置于反應容器中，真空-氮氣循環三次，加入甲醇和N,N-二甲基甲酰胺以體積比為1：1的混合物，然后再加入溴化亞銅，密封，于60℃反應24-24h，然后透析，凍干后得產物；其中單體、引發劑、配體和溴化亞銅的摩爾比為40-50:1-1.5:2-2.5:1-1.5；

(6)載藥碳點的制備

將步驟(4)所得產物和抗腫瘤藥物溶于水中，避光反應4-8h，然后透析24h，每4h換一次透析液，收集透析后的溶液，冷凍干燥后得到包載藥物的熒光碳點；其中抗腫瘤藥物和步驟(4)所得產物的質量比為1:3-5；

(7)載藥納米粒的制備

將步驟(5)制得的產物與步驟(6)制得的產物以質量比1:2-3混合，在去離子水中攪拌過夜，將得到的混合液過0.45μm濾膜，收集濾液，冷凍干燥得到載藥納米粒。