[發明專利]一種提高膜蛋白序列檢測覆蓋率的質譜樣品的制備方法

有效

• 申請號: 201711206409.9
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN107991495B
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發明（設計）人: 沈國民;沈滟;徐西兵;曹青;劉紅麗
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N1/28
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

本發明涉及一種提高膜蛋白序列檢測覆蓋率的質譜樣品的制備方法，屬于蛋白質分析技術領域。本發明的膜蛋白樣品的制備方法，將二硫鍵還原劑、半胱氨酸修飾劑處理后的樣品，采用糜蛋白酶進行消化處理，得消化樣品；將所述消化樣品中加入少量的甲酸進行終止反應，制得可以用于質譜檢測的膜蛋白樣品。本發明的制備的樣品結合高靈敏度質譜技術，能顯著提高膜蛋白序列覆蓋率，基本能達到80％以上的序列覆蓋率，且操作簡單、可信度高、重復性好。本發明的方法在研究蛋白質結構，蛋白質與蛋白質相互作用，蛋白質與小分子藥物的相互作用，靶向蛋白質的小分子藥物篩選中有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種提高膜蛋白序列檢測覆蓋率的質譜樣品的制備方法，屬于蛋白質分析技術領域。

背景技術

在所有生物的基因組中，20％-30％的基因編碼膜蛋白。人類基因組中，大約有27％的基因編碼膜蛋白。現在臨床用藥有50％以上作用靶點是膜蛋白，比如，人類基因組中G蛋白偶聯受體(GPCR)超家族大約有800個不同的基因，占總蛋白編碼基因的4％，占膜蛋白基因的14％，與GPCR相關的疾病為數眾多，并且大約40％的現代藥物都以G蛋白偶聯受體作為靶點。目前上市的藥物中，前50種最暢銷的藥物20％就屬于G蛋白受體相關藥物，比如充血性心力衰竭藥物Coreg，高血壓藥物Cozaar，乳腺癌藥物Zoladex等等。前20種暢銷藥物有7種是GPCR相關藥物，所以膜蛋白研究一直是一個熱點。

蛋白質質譜技術是研究膜蛋白性質的常用技術，在蛋白質鑒定，全新肽段測序，蛋白質定量，蛋白結構解析，蛋白生物標志物的鑒定，蛋白質組學，蛋白質翻譯后修飾，蛋白與蛋白相互作用等方面有廣泛的應用。在蛋白結構解析，蛋白質翻譯后修飾，蛋白與蛋白相互作用的研究中，常有一個技術瓶頸，就是質譜檢測的蛋白質序列覆蓋率低，特別是膜蛋白的序列覆蓋率尤其低。質譜蛋白序列覆蓋率決定能否分析到全面的信息，膜蛋白的跨膜區富含疏水性氨基酸，如亮氨酸，異亮氨酸，頡氨酸，苯丙氨酸等，因而蛋白水解后的水解肽段在水溶液中的溶解度非常低，所以蛋白質質譜很難檢測到，傳統的方法大多數只能達到20％—30％覆蓋率。嚴重影響了蛋白質質譜技術在蛋白結構解析，蛋白質翻譯后修飾，蛋白與蛋白相互作用的研究中的應用。

“In-gel digestion for mass spectrometriccharacterization of proteinsand proteomes，Nature Protocols，Andrej Shevchenko，2006”中公開了一種蛋白質譜樣品的制備方法，其中采用DTT還原二硫鍵，碘乙酰胺進行乙酰胺化，并用胰蛋白酶對凝膠條帶進行處理，最終得到的樣品可用于質譜檢測，但是該種方法制得的蛋白樣品，檢測結果的序列覆蓋率還是較低，不能滿足蛋白質質譜技術在蛋白結構解析以及蛋白與小分子相互作用研究中的需求。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高膜蛋白序列檢測覆蓋率的質譜樣品的制備方法。

為了實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種提高膜蛋白序列檢測覆蓋率的質譜樣品的制備方法，包括：將二硫鍵還原劑、半胱氨酸修飾劑處理后的樣品，采用糜蛋白酶進行消化處理，得消化樣品；將所述消化樣品中加入甲酸終止消化，即得。

本發明的提高膜蛋白序列檢測覆蓋率的質譜樣品的制備方法，本發明選用糜蛋白酶對膜蛋白進行消化處理，這樣能夠對膜蛋白進行更高效率的切割，能達到更好的切割、消化效果，有利于提高膜蛋白的質譜檢測覆蓋率；在終止時加入了甲酸終止消化，能夠對糜蛋白酶消化反應進行較好的中止。

本發明中所采用的樣品為聚丙烯酰胺凝膠塊兒，其制備包括電泳、染色、脫色、脫水。所述電泳為采用10％-15％的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。

所述染色為采用考馬斯亮藍染液室溫染色1.5-2.5分鐘。本發明中的考馬斯亮藍染色的時間較短，染色能看出目的條帶即可，染色時間短可以減少后面的脫色時間和步驟，避免脫色及染色對于蛋白質樣品的影響及傷害。