[發(fā)明專利]SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2及建立方法及應用

有效

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• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN108048403B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 陳國慶;田衛(wèi)東;李雪冰
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61L27/38;C12R1/89
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 易小藝

1.SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1(Hertwig`s epithelial root sheath,HERS-H1)和HERS-C2(Hertwig`s epithelial root sheath,HERS-C2)，其特征在于：所述赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1保藏號為CCTCC NO.C2017249，所述赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-C2保藏號為CCTCC NO.C2017250；細胞系HERS-H1及HERS-C2保存了原代赫特維希上皮根鞘細胞的特性，并且傳代至至少50代，增殖速率較原代細胞提高。

2.根據權利要求1所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)獲取大鼠原代HERS細胞；其中采用混合酶消化法進行赫特維希上皮根鞘細胞的原代培養(yǎng)；所述混合酶包括分散酶和Ⅰ型膠原酶，分散酶和Ⅰ型膠原酶的比例為1-1.2：1

(2)編碼SV40LT慢病毒轉染原代細胞，進行傳代培養(yǎng)；

(3)制備單細胞懸液及克隆擴增培養(yǎng)，用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基篩選轉染陽性的細胞；陽性轉染的單細胞克隆擴增后傳代培養(yǎng)至50代或以上，獲得HERS-H1和HERS-C2細胞系；

(4)對HERS-H1和HERS-C2細胞系進行表面標記蛋白的免疫熒光檢測；

(5)誘導液誘導其上皮間充質轉化或成骨分化。

3.根據權利要求2所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述步驟(1)中當原代HERS細胞形成集落時用胰蛋白酶消化去除間充質細胞以純化HERS細胞，純化后的HERS細胞進行傳代培養(yǎng)；當傳代的細胞密度達到70％時更換為含編碼SV40LT慢病毒的上皮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，慢病毒在培養(yǎng)基中濃度5×10⁵TU/ml。

4.根據權利要求3所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述慢病毒中編碼SV40LT的序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根據權利要求3所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述上皮培養(yǎng)基為在含100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的基礎培養(yǎng)基中加入2％體積比胎牛血清和1％體積比的上皮細胞生長因子的培養(yǎng)基，基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12。

6.根據權利要求2所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述免疫熒光檢測中將E-cadherin,Vimentin,CK14作為HERS細胞鑒定標記物。

7.根據權利要求2所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述嘌呤霉素濃度為1-5μg/ml；所述誘導液為成骨誘導液或含TGFβ1的成骨誘導液，其中成骨誘導液中包括以下重量的組份：地塞米松10^-8M，維生素C 50μg/ml，β-甘油磷酸鈉10mM，CaCl₂ 3mM，青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL；所述加入誘導液中TGFβ1濃度為2-15ng/ml。

8.根據權利要求2所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2的建立方法，其特征在于：所述制備過程中還包括使用引物組，通過實時熒光定量PCR擴增鑒定HERS表型相關基因，其擴增引物組及序列如下：

9.根據權利要求1所述的SD大鼠赫特維希上皮根鞘細胞系HERS-H1和HERS-C2在構建生物牙根中的應用，或在構建完整牙胚中的應用。