[發明專利]一種豬瘟活疫苗效力的檢測方法

在審

• 申請號: 201711200120.6
• 申請日: 2017-11-27
• 公開（公告）號: CN108220477A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 肖華春;李文春;皇培剛;曹燦花;吳艷琴;田貴云;李斌;王成業
• 申請（專利權）人: 云南生物制藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 昆明潤勤同創知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53205
• 代理人: 付石健

本發明公開了一種豬瘟活疫苗效力的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：將培養好的ST細胞進行RNA提取，PCR反應，電泳和凝膠成像。本發明的優點是，檢驗周期為4天，檢驗不需要動物。在實驗室即可完成，工作量小，效率高，影響因素可控，準確性高，操作簡單，重現性高，檢驗成本僅為原方法的三分之一左右，具有很高的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種豬瘟活疫苗效力的檢測方法。

背景技術

豬瘟活疫苗是利用豬瘟兔化弱毒株(CVCCAV1412)接種易感細胞培養，收獲培養物，加適宜穩定劑，經冷凍干燥制成。用于預防豬瘟的一種疫苗。

豬瘟活疫苗效力檢驗常規檢驗方法是用實驗兔，其檢驗周期為8天，檢驗過程繁瑣，工作量大，成本高，而且受實驗動物本身因素影響較大，實驗結果經常出現可疑現象。

發明內容

本發明提出了一種效率高、準確性高的豬瘟活疫苗效力的檢測方法。

本發明的技術方案是這樣實現的：一種豬瘟活疫苗效力的檢測方法，包括以下步驟：將培養好的ST細胞進行RNA提取，PCR反應，電泳和凝膠成像；

所述PCR反應的體系為按每50ul反應物計，含有15ul雙酶一管式RT-PCR 2倍緩沖稀釋液(雙酶一管式RT-PCR Buffer 2×)、2ul豬瘟病毒(CSFV)專性引物對、 3ul樣品RNA、28ul超純水和2ul逆轉錄酶與耐熱酶的混合物(MMLV-Taq Mix)；

其中，雙酶一管式RT-PCR 2倍緩沖稀釋液、豬瘟病毒(CSFV)專性引物對、超純水和逆轉錄酶與耐熱酶的混合物均為市售產品。

所述PCR反應的設置為：

所述電泳是將經所述PCR反應所得的反應物加入市售的上樣緩沖液，再加入至瓊脂凝膠中，在V:130v、I:400mA、T:25min由負極至正極的條件下開始電泳。

作為優選，所述RNA提取包括以下步驟：

2.1加560ul裂解緩沖液(OVL Lysis Buffer)至1.5mlEP管中，再加5.6ul轉運 RNA酶(Carry RNA)，再加10ulβ-巰基乙醇；

2.2加樣：加280ul待檢樣品，振蕩15秒，靜置5min；

2.3加無水乙醇560ul，振蕩15秒；

2.4將上述體系加入到2ml DNA收集管中，每次700ul，8000r/min離心1min，棄去下層液體；

2.5重復2.4步驟

2.6加多糖洗液(RWA wash Buffer)500ul，8000r/min離心1min，棄去下層液體；

2.7加蛋白洗液(RWB wash Buffer)500ul，8000r/min離心1min，棄去下層液體；

2.8重復2.7步驟

2.9空離：換新的1.5mlEP管，13000r/min離心2min；

2.10揮發：即換新的1.5mlEP管中，打開蓋子，揮發5-10min；

2.11洗樣：換新的1.5mlEP管，加入30ul DEPE水，放置2-3min。

作為優選，所述凝膠成像是將已電泳好的所述凝膠置于透射光為312nm處，打開凝膠成像系統軟件進行拍攝編輯圖像，判定結果。