[發明專利]飛蝗節間膜表皮蛋白基因1及其在蝗蟲防治中的應用

在審

• 申請號: 201711199235.8
• 申請日: 2017-11-26
• 公開（公告）號: CN107699569A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 趙小明;賈盼;張建珍;馬恩波
• 申請（專利權）人: 山西大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/113;A01N57/16;A01P7/04
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司)14105
• 代理人: 張福增

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種飛蝗節間膜表皮蛋白基因(LmAbd1)及在害蟲防治中的應用。

背景技術

飛蝗是我國重要農業害蟲，由于其具有翅可以在陸地之間長距離遷移飛行，從而在覓食、求偶、避敵和擴大分布效率等方面都得到大幅度提高，對農業生產造成嚴重危害。飛蝗成蟲的體長，雄蟲為32.4～48.1毫米，雌蟲為38.6～52.8毫米。在正常情況下，成蟲羽化后平均7天左右即可交配，雌蟲一生可進行多次交配，交配后4～7天即可產卵在土下，深度約為4～6厘米。卵產下時分泌粘液膠著卵粒形成卵囊。每頭雌蟲一般可產卵囊4～5塊，每塊一般含卵50～80粒，一生所產卵粒總數平均為200～400粒。飛蝗能夠深入土下產卵是由于其雌蟲節間膜具有延伸性。飛蝗共有9個附節，8個節間膜，節間膜中含有大量表皮蛋白。表皮蛋白是昆蟲表皮重要組成成分，在表皮結構形成中具有重要作用，其成分的缺失或含量變化都會引起表皮功能異常甚至功能喪失，從而影響昆蟲的生長發育。在飛蝗生殖中，當表皮蛋白含量減少后其節間膜結構可被破壞而不能延展，導致無法深入土下產卵，進而導致其后代種群數量減少。

目前對蝗災的防治主要依靠化學防治，然而長期施用化學殺蟲劑導致一系列問題，如環境污染，抗藥性產生和對非靶標生物的危害等。因此，開發新型、可替代化學防治的方法變得極其緊迫。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默的現象，自2006年獲得諾貝爾獎以來，RNAi技術一直躋身于科技前沿。RNAi不僅是研究基因功能的有力工具，同時在害蟲防治方面也具有極大潛力。通過RNA干擾進行害蟲防治具有如下特點：1)殺蟲具有專一性，對非靶標生物無殺傷作用；2)RNA在自然界極易降解，無殘留；3)對環境無毒無害，相對安全。因此學者將其稱為第四代殺蟲劑。基于RNA干擾進行害蟲防治的基礎技術是篩選靶標序列獲得具有高致死作用的dsRNA。

針對飛蝗產卵生殖的特點，本發明基于RNA干擾技術，選取飛蝗節間膜表皮蛋白基因為對象，利用其重要生物學功能來進行害蟲防治，安全高效，是一種環境友好型、對人類無毒無害、特異性的新型分子靶標的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種飛蝗節間膜表皮蛋白基因(LmAbd1)全長序列及其合成的dsRNA在蝗蟲防治中的應用。

本發明提供一種飛蝗節間膜表皮蛋白基因全長序列，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO：1。該基因全長序列是基于飛蝗轉錄組數據庫，搜索獲得的片段通過GeneDoc軟件結合飛蝗基因組序列對其進行拼接，然后經PCR全長擴增、克隆測序獲得。該核苷酸長度為926bp，ORF序列全長582bp，編碼193個氨基酸，分子量為20.9KD，理論等電點為5.19，含有一個信號肽以及一個RR-1型幾丁質結合域。

本發明提供的一種飛蝗節間膜表皮蛋白基因，其核苷酸序列分別是SEQ ID NO：2，是根據SEQ ID NO：1通過primer premier5.0軟件設計含有T7啟動子的上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，通過PCR擴增獲得SEQ ID NO：2，其產物含有T7啟動子。產物經純化后按照T7RiboMAX^TM Express RNAi System(Promega)試劑盒說明體外轉錄分別合成dsRNA(dsLmAbd1)。

SEQ ID NO：2合成的dsRNA在飛蝗防治中的應用：通過微量進樣器將SEQ ID NO：2合成的dsRNA注射進入5齡2天飛蝗若蟲體腔內。結果表明：和對照相比，SEQ ID NO：2合成的dsRNA可以特異性地、極顯著的沉默一種飛蝗節間膜表皮蛋白基因(LmAbd1)的mRNA表達，并導致成蟲蟲體出現蛻皮困難，節間膜無法閉合，最終導致害蟲腹部無法深入土中產卵而導致卵囊數和卵粒數顯著減少。

與現有技術相比本發明的有益效果：本發明經多次實驗，表明注射dsRNA能導致飛蝗后代卵粒數減少量達到31.7％以上。本發明的特異性及高效性，對于減少害蟲產卵數和后代種群數量具有顯著效果，可以為害蟲防治提供新的途徑。

附圖說明

圖1：一種飛蝗節間膜表皮蛋白基因(LmAbd1)在飛蝗雌雄成蟲不同位置節間膜中的表達差異，β-actin做為內參基因。

圖2：飛蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA 24小時后，一種飛蝗節間膜表皮蛋白基因(LmAbd1)的mRNA沉默情況，β-actin做為內參基因，其中***P<0.001。