[發(fā)明專利]一種敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201711197296.0 | 申請日： | 2017-11-25 |
| 公開（公告）號： | CN109837246A | 公開（公告）日： | 2019-06-04 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張宏玲;龍麗梅;鐘春穎 | 申請（專利權(quán)）人： | 深圳賓德生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/10 | 分類號： | C12N5/10;C12N15/867;C12N7/01;C12N15/113;A61P35/00 |
| 代理公司： | 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202 | 代理人： | 郝傳鑫;熊永強 |
| 地址： | 518000 廣東省深圳市*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 嵌合抗原 靶向 敲除 轉(zhuǎn)染 制備方法和應(yīng)用 陽性T淋巴細胞 殺傷腫瘤細胞 重組慢病毒 編碼基因 免疫監(jiān)視 正常細胞 腫瘤細胞 基因 構(gòu)建 擴增 制備 損傷 體內(nèi) 細胞 | ||
1.一種敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，包括：
(1)提供嵌合抗原受體CAR-ROR1的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號肽的編碼基因、靶向ROR1的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區(qū)的編碼基因、跨膜區(qū)的編碼基因、胞內(nèi)信號區(qū)的編碼基因，其中，所述靶向ROR1的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(2)將所述CAR-ROR1的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPXLD-CAR-ROR1重組質(zhì)粒；
(3)包裝所述pWPXLD-CAR-ROR1重組質(zhì)粒，得到重組慢病毒；
(4)將所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染CD3陽性T淋巴細胞，獲得嵌合抗原受體T細胞；
(5)敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞。
2.如權(quán)利要求1所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述胞外鉸鏈區(qū)包括CD8α鉸鏈區(qū)，所述跨膜區(qū)包括CD8跨膜區(qū)，所述胞內(nèi)信號區(qū)包括4-1BB信號區(qū)和CD3ζ信號區(qū)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述嵌合抗原受體CAR-ROR1的編碼基因包括如SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述包裝所述pWPXLD-CAR-ROR1重組質(zhì)粒，得到重組慢病毒包括：
將所述pWPXLD-CAR-ROR1重組質(zhì)粒與包膜質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細胞，得到所述重組慢病毒。
5.如權(quán)利要求1所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，包括：
將所述Cas9的編碼基因插入至pcDNA3.1載體中，得到pcDNA3.1-cas9重組質(zhì)粒，以所述pcDNA3.1-cas9重組質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄得到Cas9mRNA；
提供靶向PD1基因的sgRNA對應(yīng)的基因序列；將所述靶向PD1基因的sgRNA對應(yīng)的基因序列插入至pcDNA3.1載體中，得到pcDNA3.1-PD1-sgRNA重組質(zhì)粒，以所述pcDNA3.1-PD1-sgRNA重組質(zhì)粒為模板進行體外轉(zhuǎn)錄得到sgRNA；
將所述Cas9mRNA和所述靶向PD1基因的sgRNA與所述嵌合抗原受體T細胞進行混合，并置于電轉(zhuǎn)儀中進行電轉(zhuǎn)，完成所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因的敲除。
6.如權(quán)利要求5所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述靶向PD1基因的sgRNA對應(yīng)的基因序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
7.如權(quán)利要求5所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，所述Cas9mRNA和所述PD1基因的sgRNA的質(zhì)量比為1:1-1:5。
8.如權(quán)利要求1-7任一項所述的方法制備得到的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞不包括PD1基因，所述敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞包括靶向ROR1的嵌合抗原受體CAR-ROR1，所述靶向ROR1的嵌合抗原受體CAR-ROR1包括從氨基端到羧基端順次連接的靶向ROR1的單鏈抗體、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號區(qū)的氨基酸序列，其中，所述靶向ROR1的單鏈抗體包括如SEQID NO：1所示的氨基酸序列。
9.如權(quán)利要求8所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，所述靶向ROR1的嵌合抗原受體CAR-ROR1的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
10.一種如權(quán)利要求1-7任一項所述的制備方法制得的或如權(quán)利要求8-9任一項所述的敲除PD1的靶向ROR1的嵌合抗原受體T細胞在制備預(yù)防、診斷和治療惡性腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
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