[發明專利]一種敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711197254.7
• 申請日: 2017-11-25
• 公開（公告）號: CN109837304A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 曾瀅;鐘春穎
• 申請（專利權）人: 深圳賓德生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N7/01;C12N15/113;C12N5/10;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

本發明提供了一種敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，包括：將嵌合抗原受體CAR?HER2的編碼基因與載體相連，進行重組慢病毒的構建，并轉染CD3陽性T淋巴細胞，將轉染后的T細胞的PD1基因進行敲除，得到靶向HER2嵌合抗原受體T細胞。所述靶向HER2嵌合抗原受體T細胞敲除了PD1基因，有利于T細胞在患者體內的擴增，避免腫瘤細胞逃脫免疫監視，具有高效且特異性的殺傷腫瘤細胞的性能，持久地維持細胞的活力和殺傷力，并且對正常細胞不會造成損傷。

技術領域

本發明涉及醫學生物領域，特別涉及一種敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞及其制備方法和應用。

背景技術

全球乳腺癌發病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢，乳腺癌已成為當前社會的重大公共衛生問題。在臨床上，人上皮生長因子受體2(human epi dermal growthfactor receptor-2，HER2)是重要的乳腺癌預后判斷因子，與乳腺癌的擴散轉移密切相關。HER2是人上皮生長因子受體家族的成員，HER2基因產物正常表達于分泌腺上皮細胞，當其基因拷貝異常增加，將會驅動所在細胞的惡變及擴增。據統計，乳腺癌患者中，約20～30％的患者為HER2陽性。相比HER2陰性的乳腺癌，HER2陽性的乳腺癌侵襲性強，復發、轉移風險高，激素治療和常規治療反應差，預后不良，給患者帶來沉重的打擊。此外，HER2除了參與乳腺癌的發生、發展外，其還在胃癌、結腸癌、膀胱癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、食管癌等多種形式的癌癥中過表達。

嵌合抗原受體T細胞技術(Chimeric Antigen Receptor–Modified T Cells，CAR-T)作為當前最新的免疫細胞技術之一，因其能夠在體內能激活自身免疫系統，持續性地靶向腫瘤細胞進行殺傷，最終達到完全清除惡性腫瘤細胞，受到廣泛的關注和研究。但是，CART技術目前的應用還局限于血液瘤，對于HE R2陽性實體瘤還未有相關研究。

程序性死亡蛋白(PD1)是免疫檢查點抑制(immune checkpoint inhibition)中的代表性分子，在機體免疫中通過阻止T細胞激活來負向調節免疫反應，以防止自身免疫疾病并保證自體耐受。在腫瘤微環境中，PD1會抑制殺傷性T細胞的活性，從而使腫瘤細胞逃脫免疫監視。目前還未有敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞且可避免腫瘤細胞逃脫免疫監視的研究。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞，所述敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞敲除了PD1基因，有利于T細胞在患者體內的擴增，避免腫瘤細胞逃脫免疫監視，具有高效且特異性識別表面具有HER2抗原蛋白的腫瘤細胞，并激活T細胞的免疫作用對HER2陽性腫瘤細胞進行殺傷，具有更加持久細胞活力和殺傷力，并且對正常細胞不會造成損傷。

第一方面，本發明提供了一種敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，包括：

(1)提供嵌合抗原受體CAR-HER2的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號肽的編碼基因、靶向HER2的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區的編碼基因、跨膜區的編碼基因、胞內信號區的編碼基因，其中，所述靶向HER2的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-HER2的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPX LD-CAR-HER2重組質粒；

(3)包裝所述pWPXLD-CAR-HER2重組質粒，得到重組慢病毒；

(4)將所述重組慢病毒轉染CD3陽性T淋巴細胞，獲得嵌合抗原受體T細胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受體T細胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向HER2的嵌合抗原受體T細胞。

可選的，所述靶向HER2的單鏈抗體的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。