[發(fā)明專利]一種敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請日: 2017-11-25
• 公開（公告）號: CN109837243A
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張宏玲;龍麗梅
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳賓德生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/01;C12N15/113;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強(qiáng)

本發(fā)明提供了一種敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括：將靶向DR5的嵌合抗原受體CAR?DR5的編碼基因與載體相連，進(jìn)行重組慢病毒的構(gòu)建，并轉(zhuǎn)染CD3陽性T淋巴細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染后的T細(xì)胞的PD1基因進(jìn)行敲除，得到敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞。所述敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞敲除了PD1基因，有利于T細(xì)胞在患者體內(nèi)的擴(kuò)增，避免腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，具有高效且特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞的性能，持久地維持細(xì)胞的活力和殺傷力，并且對正常細(xì)胞不會造成損傷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域，特別涉及一種敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

癌癥已成為威脅人類生命的元兇，發(fā)病率成上升趨勢，人們從尋找誘導(dǎo)引起腫瘤細(xì)胞凋亡或者克服腫瘤細(xì)胞對凋亡耐受的角度入手，發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，是能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的腫瘤壞死因子超家族成員。死亡受體5(death receptor5；DR5)屬腫瘤壞死因子受體超家族成員(TN FRSF10B)，其胞質(zhì)區(qū)含死亡結(jié)構(gòu)域，分布于腫瘤細(xì)胞、淋巴組織和活化的T細(xì)胞。TRAIL與細(xì)胞表面DR5結(jié)合，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。DR5在肝癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而在普通細(xì)胞中表達(dá)很微弱的細(xì)胞表面抗原。

程序性死亡蛋白(PD1)是表達(dá)于T細(xì)胞和前體B細(xì)胞膜上的受體蛋白的一種，屬于免疫球蛋白超家族。PD1是免疫檢查點(diǎn)抑制(immune checkpoint in hibition)中的代表性分子，在機(jī)體免疫中通過阻止T細(xì)胞激活來負(fù)向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，以防止自身免疫疾病并保證自體耐受。在腫瘤微環(huán)境中，PD1會抑制殺傷性T細(xì)胞的活性，從而使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視。

免疫細(xì)胞治療是現(xiàn)有科技中唯一有可能徹底清除癌細(xì)胞的方法，其治療腫瘤具有特異性強(qiáng)、幾乎無毒副作用的巨大優(yōu)勢彌補(bǔ)了傳統(tǒng)療法的弊端，在國內(nèi)外已經(jīng)用于臨床治療惡性腫瘤，嵌合抗原受體T細(xì)胞技術(shù)(CAR-T)為當(dāng)前過繼性細(xì)胞回輸治療技術(shù)最新的免疫細(xì)胞技術(shù)之一，因其能夠在體內(nèi)能激活自身免疫系統(tǒng)，持續(xù)性地靶向腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，最終達(dá)到清除惡性腫瘤細(xì)胞的目的而受到廣泛的關(guān)注和研究。目前還未有靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞且可避免腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視的研究。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞，所述敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞敲除了PD1基因，有利于T細(xì)胞在患者體內(nèi)的擴(kuò)增，避免腫瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，具有高效且特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞的性能，更好的維持細(xì)胞的活力和殺傷力，并且對正常細(xì)胞不會造成損傷。

第一方面，本發(fā)明提供了一種敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞的制備方法，包括：

(1)提供靶向DR5的嵌合抗原受體CAR-DR5的編碼基因，包括從5’端到3’端順次連接的信號肽的編碼基因、靶向DR5的單鏈抗體的編碼基因、胞外鉸鏈區(qū)的編碼基因、跨膜區(qū)的編碼基因、胞內(nèi)信號區(qū)的編碼基因，其中，所述靶向DR5的單鏈抗體的編碼基因包括編碼如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；

(2)將所述CAR-DR5的編碼基因插入到pWPXLD載體中，得到pWPXL D-CAR-DR5重組質(zhì)粒；

(3)包裝所述pWPXLD-CAR-DR5重組質(zhì)粒，得到重組慢病毒；

(4)將所述重組慢病毒轉(zhuǎn)染CD3陽性T淋巴細(xì)胞，獲得嵌合抗原受體T細(xì)胞；

(5)敲除所述嵌合抗原受體T細(xì)胞的PD1基因，獲得敲除PD1的靶向DR5的嵌合抗原受體T細(xì)胞。

可選的，所述靶向DR5的單鏈抗體的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

可選的，所述靶向DR5的單鏈抗體的氨基酸序列的編碼基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。