[發明專利]一種臨床級神經干細胞的制備方法

有效

• 申請號: 201711191201.4
• 申請日: 2017-11-24
• 公開（公告）號: CN108070558B
• 公開（公告）日: 2022-01-28
• 發明（設計）人: 李超;姜麗君;畢薇薇
• 申請（專利權）人: 吉林省拓華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;程云

1.一種臨床級神經干細胞的制備方法，其包括：

a)通過市售人神經干細胞系，以提供單個的人神經干細胞；

b)以3×10⁵/ml至5×10⁵/ml的濃度，將所述人神經干細胞接種到常規培養瓶中維持12至24小時；

c)以1×10⁵/ml至3×10⁵/ml的濃度，將所述人神經干細胞轉移至低吸附培養瓶，

所述低吸附培養瓶中的培養基由以下組成：DMEM/F12無血清培養基、50ng/mL至100ng/mL腫瘤壞死因子-α、按質量/體積計10％至15％白蛋白、按質量/體積計1％至2％B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF、20ng/m至30ng/mL CNTF、10ng/ml至20ng/mlIGF-1；

d)每3至5天，進行半量換液；

e)每6至9天，對所述人神經干細胞進行傳代；

f)收獲第3至11代的人神經干細胞；

所述人神經干細胞來自選自以下的任一項：海馬、大腦皮質。

2.根據權利要求1所述的方法，其中：

所述常規培養瓶中的培養基由以下組成：DMEM/F12無血清培養基、1％至2％的B27、20ng/ml至30ng/ml EGF、20ng/ml至30ng/ml bFGF。

3.根據權利要求1所述的方法，其中，在傳代時用Accutase酶和木瓜蛋白酶消化所述人神經干細胞。

4.根據權利要求3所述的方法，其中所述Accutase酶和所述木瓜蛋白酶的質量比為1：1。

5.根據權利要求1所述的方法，其中：

步驟d)中，每4天進行半量換液。

6.根據權利要求1所述的方法，其中：

步驟e)中，每8天對所述人神經干細胞進行傳代，并計數細胞數量和/或活性檢測。

7.根據權利要求1所述的方法，其中：

步驟f)中，收獲第4代的人神經干細胞。

8.根據權利要求1所述的方法，其中所述的維持是通過以下進行的：放置在37℃、5％CO₂恒溫培養箱中培養。

9.根據權利要求1所述的方法，其中所述的傳代是通過以下進行的：

當60％以上的所述人神經干細胞的細胞球生長至200μm至500μm時，消化所述人神經干細胞；

以1×10⁵/ml至3×10⁵/ml的濃度，將所述人神經干細胞接種至低吸附培養瓶中，在37℃、5％CO₂恒溫培養箱中培養。

10.根據權利要求9所述的方法，其中所述的傳代是通過以下進行的：

當80％以上的所述人神經干細胞的細胞球生長至200μm至400μm時，消化所述人神經干細胞；

以1×10⁵/ml至3×10⁵/ml的濃度，將所述人神經干細胞接種至低吸附培養瓶中，在37℃、5％CO₂恒溫培養箱中培養。

11.根據權利要求1所述的方法，其中所述海馬是海馬齒狀回。

12.一種人神經干細胞培養基，其由以下組成：

DMEM/F12無血清培養基、

50ng/mL至100ng/mL腫瘤壞死因子-α、

10％至15％白蛋白、

1％至2％B27、

20ng/ml至30ng/ml EGF、

20ng/ml至30ng/ml bFGF、

20ng/m至30ng/mL CNTF、

10ng/ml至20ng/ml IGF-1。

13.一種人神經干細胞培養基，其由以下組成：

DMEM/F12無血清培養基、

100ng/mL腫瘤壞死因子-α、

15％白蛋白、

2％B27、

20ng/ml EGF、

20ng/ml bFGF、

30ng/mL CNTF、

10ng/ml IGF-1。