[發明專利]一種酶反應合成1,2,4-丁三醇的方法

有效

• 申請號: 201711190972.1
• 申請日: 2017-11-24
• 公開（公告）號: CN107674889B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 陳可泉;高倩;王昕;胡社偉;許娜娜;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12P7/18
• 分類號: C12P7/18
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種酶反應合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，以D-木糖脫氫酶、D-木糖酸脫水酶、苯甲酰甲酸脫羧酶、醇脫氫酶為催化劑，在反應體系中催化D-木糖轉化為D-1,2,4-丁三醇；所述反應體系包括如下組分：20～100mM PBS、MgCl₂ 1～10mM、NAD⁺ 0.1～0.8mM、NADH0.1～0.8mM、TPP 0.1～0.6mM；

所述D-木糖脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；D-木糖酸脫水酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；苯甲酰甲酸脫羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示；醇脫氫酶的核苷酸序列如SEQ ID NO .4所示；

所述D-木糖脫氫酶的含量為200～400U/mL，所述D-木糖酸脫水酶的含量為100～300U/mL，苯甲酰甲酸脫羧酶的含量為100～300U/mL，醇脫氫酶的含量為200～350U/mL。

催化反應的溫度為33～37℃，反應時間為12～24h；

所述的D-木糖的濃度為10～25g/L。

2.根據權利要求1所述的酶反應合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，所述D-木糖脫氫酶、D-木糖酸脫水酶、苯甲酰甲酸脫羧酶、醇脫氫酶的制備方法如下：

(1)將SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列分別導入質粒中，得到重組質粒，然后將重組質粒分別轉化宿主菌，得到重組菌；

(2)在重組菌中分別誘導表達D-木糖脫氫酶、D-木糖酸脫水酶、苯甲酰甲酸脫羧酶、醇脫氫酶；

(3)利用超聲波破碎儀破碎各重組菌菌體，分別收集粗酶液，再利用鎳柱對D-木糖脫氫酶、D-木糖酸脫水酶、苯甲酰甲酸脫羧酶、醇脫氫酶進行純化，收集純化后的酶液，利用超濾管對其進行除鹽和濃縮，即分別得到D-木糖脫氫酶、D-木糖酸脫水酶、苯甲酰甲酸脫羧酶、醇脫氫酶。

3.根據權利要求2所述的酶反應合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步驟(3)中，利用鎳柱純化D-木糖脫氫酶、D-木糖酸脫水酶、苯甲酰甲酸脫羧酶、醇脫氫酶的方法如下： 利用PBS緩沖液分別將各重組菌重懸，超聲破碎重組菌，得到4種酶的粗酶液，將粗酶液 分別從鎳柱中流出，使蛋白結合在鎳柱上，然后利用結合緩沖液洗脫雜蛋白，再用洗脫緩沖 液洗脫目標蛋白；所述的結合緩沖液的配方如下：20mM Tris、0 .5M NaCl、50mM咪唑，HCl調至pH7.0； 所述的洗脫緩沖液的配方如下：20mM Tris、0 .5M NaCl、500mM咪唑、HCl調至pH7.0。

4.根據權利要求2所述的酶反應合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的質粒為PRSF Duet-1。

5.根據權利要求2所述的酶反應合成1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。