[發明專利]一種八氫番茄紅素脫氫酶突變基因及其在類胡蘿卜素合成中的應用

在審

• 申請號: 201711190198.4
• 申請日: 2017-11-24
• 公開（公告）號: CN108034665A
• 公開（公告）日: 2018-05-15
• 發明（設計）人: 陳艷;丁國芳;楊最素;余方苗;唐云平;黃芳芳
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12P5/02
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

一種八氫番茄紅素脫氫酶突變基因及其在類胡蘿卜素合成中的應用，所述的突變體基因是通過迭代定向進化手段對八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因進行多輪突變，以及一種基于菌落顏色變化的高通量篩選方法，最終獲得了八氫番茄紅素脫氫酶的突變體基因；用所述八氫番茄紅素脫氫酶突變基因合成番茄紅素時，第一輪定向進化獲得了A178S突變體，番茄紅素產量提高27.3%；進而以該突變體為基礎進行定向進化，得到A178S/N280T突變體和A178S/M234I兩個突變體，番茄紅素產量進一步提高51.4%和18.3%，而將A178S、N280T及M234I組合未能進一步提高番茄紅素產量；繼續對A178S/N280T突變體進行定向進化，獲得A178S/N280T/E239P突變體，通過3輪定向進化和篩選，最終獲得A178S/N280T/E239P突變體。

技術領域

本發明涉及的是一種八氫番茄紅素脫氫酶突變基因及其在類胡蘿卜素合成中的應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

在類胡蘿卜素生物合成過程中，八氫番茄紅素脫氫酶催化由八氫番茄紅素生成番茄紅素的連續四步脫氫反應，是途徑關鍵限速酶。因此，提高八氫番茄紅素脫氫酶的催化活性獲得優選的八氫番茄紅素脫氫酶對于提高類胡蘿卜素生物合成路徑的生產力有著至關重要的意義。

然而，目前關于八氫番茄紅素脫氫酶CrtI 與底物結合的結構和結合機制尚未得到解析。在缺乏酶結構或催化機理信息的情況下，定向進化技術是提高酶催化性能的有力工具。因此，通過定向進化技術獲得優選的八氫番茄紅素脫氫酶能夠有效提高類胡蘿卜素生物合成的生產力。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足，而提供一種八氫番茄紅素脫氫酶的突變基因及其在類胡蘿卜素合成中的應用。

本發明的目的是通過如下技術方案來完成的，一種八氫番茄紅素脫氫酶突變體基因，所述的突變體基因是通過迭代定向進化手段對八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因進行多輪突變，以及一種基于菌落顏色變化的高通量篩選方法，最終獲得了八氫番茄紅素脫氫酶的突變體基因。

作為優選：首先將來源于水生副球菌Agrobacterium aurantiacum的八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因crtI插入解脂耶式酵母整合表達單拷貝載體pINA1269中，然后采用易錯PCR技術對crtI進行突變，通過觀察番茄紅素生產菌株的菌落顏色變化的初篩方法和HPLC方法驗證篩選正向突變體，并對目標正向突變體進行測序，獲得了八氫番茄紅素脫氫酶的突變體基因。

一種如上所述八氫番茄紅素脫氫酶突變體基因在類胡蘿卜素合成中的應用，用所述八氫番茄紅素脫氫酶突變基因合成番茄紅素時，第一輪定向進化獲得了A178S突變體，番茄紅素產量提高27.3%；進而以該突變體為基礎進行定向進化，得到A178S/N280T突變體和A178S/M234I兩個突變體，番茄紅素產量進一步提高51.4%和18.3%，而將A178S、N280T及M234I組合未能進一步提高番茄紅素產量；繼續對A178S/N280T突變體進行定向進化，獲得A178S/N280T/E239P突變體，番茄紅素產量進一步提高40.3%；通過3輪定向進化和篩選，最終獲得A178S/N280T/E239P突變體，該突變體將番茄紅素產量從3.2 mg/g DCW提高到8.7mg/g DCW，提高了171.9%。

本發明通過迭代定向進化手段對八氫番茄紅素脫氫酶編碼基因進行多輪突變，以及一種基于菌落顏色變化的高通量篩選方法，最終獲得了八氫番茄紅素脫氫酶的突變體基因；應用上述八氫番茄紅素脫氫酶突變基因合成番茄紅素時，將重組解脂耶式酵母菌株生產番茄紅素的產量較原始基因提高了171.9%。

具體實施方式