[發(fā)明專利]一種煙草對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定方法

在審

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• 申請日: 2017-11-24
• 公開（公告）號: CN107904255A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 彭玉富;徐世曉;楊鐵釗;朱智志;楊永鋒;王根發(fā);楊宗燦;程向紅;張展;薛剛
• 申請（專利權(quán)）人: 河南中煙工業(yè)有限責任公司;河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所(普通合伙)41104
• 代理人: 時立新

1.一種煙草對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

（一）制備PVY-NIB基因，并構(gòu)建瞬時表達載體PVX:pND108-NIB；具體而言：

首先，制備PVY-NIB基因，所述PVY-NIB基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示；

其次，對pND108空載體進行雙SalI、Notl雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物；

最后，將pND108空載體的雙酶切產(chǎn)物與PVY-NIB基因進行連接，轉(zhuǎn)化并篩選鑒定后，構(gòu)建獲得瞬時表達載體PVX:pND108-NIB；

（二）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株，制備轉(zhuǎn)染用菌液，具體而言：

將步驟（一）中所制備瞬時表達載體PVX:pND108-NIB轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株，所述農(nóng)桿菌菌株采用農(nóng)桿菌LBA4404菌株或農(nóng)桿菌GV3101菌株；

轉(zhuǎn)化完成后，篩選陽性轉(zhuǎn)化菌株并鑒定，對鑒定正確菌株進一步培養(yǎng)制備浸染用菌液；

（三）浸染煙草葉片，鑒定煙草對南方根結(jié)線蟲的抗性，具體而言：

將待鑒定煙草品種種子播種后，選取生長6~8周的煙草葉片作為鑒定材料；

吸取步驟（二）中所制備浸染用菌液，對鑒定材料進行浸潤處理，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察葉片的生長情況；

若煙草葉片上表現(xiàn)出過敏性壞死反應(yīng)，表明該煙草品種對南方根結(jié)線蟲具有抗性；

若煙草葉片上未表現(xiàn)出任何異常狀況，表明該煙草品種對南方根結(jié)線蟲是易感的，不具有抗性。

2.如權(quán)利要求1所述煙草對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定方法，其特征在于，步驟（二）中，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404菌株時，采用電擊法轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株時，采用凍融法轉(zhuǎn)化。

3.如權(quán)利要求1所述煙草對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定方法，其特征在于，步驟（二）中，對陽性轉(zhuǎn)化菌株進行鑒定時，采用菌液PCR方式進行鑒定，鑒定時，引物序列設(shè)計如下：

PVY-MSNR F：5'- AACCGTGGATACGGAAGCAG-3'，

PVY-MSNR R：5'-CCACTACAGTCGAAGGCTGG-3'。

4.如權(quán)利要求1所述煙草對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定方法，其特征在于，該方法用于煙草品種抗性鑒定時，所述煙草品種為：T.I706、YZ90、NC95、G-28、Y8190、K326、Coker176、中煙14、Coker86、Mc nair373、Speight G-15、Speight G-33、Speight G-52、Virginia Gold、NC55、NC71、NC89、云煙87、中煙90、紅大、長脖黃、KY14、NC2326。

5.權(quán)利要求1所述煙草對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定方法在煙草育種中的應(yīng)用，其特征在于，用于煙草品種對南方根結(jié)線蟲抗性的鑒定。