[發明專利]基于肽核酸探針的Wnt信號通路中FoxM1基因P271Q突變的檢測試劑

在審

• 申請號: 201711188141.0
• 申請日: 2015-06-24
• 公開（公告）號: CN107828871A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 唐景峰;陳興珍;周策凡;張毅;代俊;周夢舟
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司42104
• 代理人: 朱盛華

本發明是《基于肽核酸探針的Wnt信號通路中FoxM1基因突變的檢測試劑、PCR檢測方法及應用》(申請號201510355452.6，申請日150624)的分案申請。

技術領域

本發明屬于分子生物學生物核酸檢測技術領域，具體涉及一種基于肽核酸探針的Wnt信號通路中FoxM1基因突變的檢測試劑、PCR檢測方法及應用。

背景技術

Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關重要的作用。如果這條信號通路中的關鍵蛋白發生突變或者異常表達，導致信號異常活化，就可能誘導癌癥的發生。Wnt信號通路包括經典的Wnt信號通路與非經典的Wnt信號通路，在經典通路即Wnt-β-catenin信號通路中，Wnt因子通過激活細胞膜上的Frizzle/LRP5/6協同受體后抑制細胞內游離β-catenin蛋白的磷酸化和降解，細胞質中的β-catenin蛋白水平升高后將發生β-catenin蛋白的核移位，導致細胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能夠聯合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同與TCF/LEF-1轉錄因子家族形成復合體并激活Wnt信號通路下游靶基因的轉錄激活。

FoxM1蛋白是Wnt信號通路中β-catenin下游重要成員之一，目前越來越多的研究已經發現，除了Pygo2蛋白外，在很多腫瘤中FoxM1蛋白也呈現高表達。

目前研究核心信號通路的核心分子調控機制，以及某些重要成員在細胞中的表達水平，已經成為治療腫瘤的一種關鍵手段，雖然近年來Wnt信號通路在癌癥中的研究，以及FoxM1蛋白作為Wnt信號通路重要成員其表達水平的研究，已經成為研究開發腫瘤藥物急需解決的重要問題，但是同時其在很多腫瘤細胞中基因的突變也越來越多，對FoxM1蛋白發揮功能起著非常重要的作用，例如在肺腺癌細胞中檢測出S55C突變、R256G突變，皮膚黑色素瘤細胞中檢測出P271Q突變，膀胱尿路上皮癌細胞中檢測出的L318F突變。

肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠優于DNA/DNA或DNA/RNA，表現在很高的雜交穩定性、優良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

發明內容

本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種能確定Wnt信號通路中核心的信號分子FoxM1基因突變情況，能解釋核心分子FoxM1在腫瘤細胞中變化，結果重復性，敏感性好的基于肽核酸探針的Wnt信號通路中FoxM1基因P271Q突變的檢測試劑。

本發明目的的實現方式為，基于肽核酸探針的Wnt信號通路中FoxM1基因P271Q突變的檢測試劑，包括引物和探針，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探針為肽核酸探針；

所述檢測FoxM1基因P271Q突變正向引物如序列表中SEQ ID NO.5；

所述檢測FoxM1基因P271Q突變反向引物如序列表中SEQ ID NO.6；

所述檢測FoxM1基因P271Q突變PNA熒光探針如序列表中SEQ ID NO.11。

所述肽核酸熒光探針的5'端和3'端分別用熒光報告基團和淬滅基團修飾，修飾所述5'端的熒光報告基團為：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修飾所述3'端的淬滅基團為：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。

基于肽核酸探針的Wnt信號通路中FoxM1基因突變的檢測試劑進行檢測的方法，檢測方法為基于肽核酸為熒光探針的實時熒光定量PCR方法；