[發明專利]一種人工生物膜系統以及制備方法和應用

在審

• 申請號: 201711182632.4
• 申請日: 2017-11-23
• 公開（公告）號: CN107987148A
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 夏小兵;彭艷春;李子劍;陳智杰
• 申請（專利權）人: 蘇州因湃生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/81;C07K16/18;A61K39/395;A61P3/10
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司32103
• 代理人: 孫仿衛,周敏

技術領域

本發明屬于免疫學領域，具體涉及一種人工生物膜系統以及制備方法和應用。

背景技術

橫跨生物膜兩次以上的蛋白統稱為多跨膜區整合膜蛋白，主要包括G蛋白偶聯受體，離子通道，轉運蛋白。多跨膜區整合膜蛋白約占細胞總蛋白的30%，是三分之二以上藥物的靶點。多跨膜區整合膜蛋白主要由疏水性氨基酸組成，蛋白的大部分被生物膜的脂質雙分子層所覆蓋。在分離純化多跨膜區整合膜蛋白的時候要使用特定去污劑溶解細胞膜。此后去垢劑能取代細胞膜覆蓋跨膜區整合膜蛋白的疏水性部位，形成蛋白/去垢劑復合物。由于去垢劑和構成細胞膜的脂類物質特性不一樣，這樣在蛋白/去垢劑復合物中的多跨膜區整合膜蛋白大多不具備原始蛋白的結構和功能。

保持多跨膜區整合膜蛋白結構和功能完整性的有效方法是將純化后的蛋白重新構建到人工生物膜中。最常見的人工生物膜是人工脂質體（liposome），這是一種由磷脂組成的雙層脂分子球體。分離純化后的多跨膜區整合膜蛋白可以重新嵌入人工脂質體中，并恢復其結構和功能完整性。重新嵌入時蛋白質溶液和脂類分子的重量比例一般是1:100以上，因此在人工脂質體中多跨膜區整合膜蛋白的濃度低。

盡管多跨膜區整合膜蛋白是目前三分之二小分子藥物的靶點，但是小分子藥物對靶點的選擇性通常較差。抗體由于其安全性、有效性和高度特異性，目前已經廣泛用于腫瘤、自身免疫以及感染性疾病等的治療?？梢灶A見功能性多跨膜區整合膜蛋白的抗體具有顯著臨床和研究意義。鈉葡萄糖共轉運蛋白(SGLT) 包括SGLT1以及SGLT2，屬于多跨膜區整合膜蛋白。他們主要分布在小腸以及腎小管，是葡萄糖的主要吸收蛋白，其中抑制SGLT2的功能能有效降低人II型糖尿病人血糖含量。鈉葡萄糖共轉運蛋白SGLT2是目前主要在研的糖尿病藥物靶點之一。已經批準或者還處于研發后期（III臨床）用于II型糖尿病SGLT2的小分子抑制劑已經有達到7種之多。

現階段還是采用制備水溶性蛋白抗體的方法來制備多跨膜區整合膜蛋白抗體，即以分離純化的蛋白或者蛋白中的一個多肽片段為抗原來免疫動物。這種方法一般獲得特異抗體的成功率低，主要原因包括：1）多跨膜區整合膜蛋白的特異性抗原表位在很大程度上依賴于生物膜的存在，由于失去了生物膜，蛋白產生結構變化，抗原表位也隨之喪失；2）蛋白的特異性表位抗體識別的往往是跨膜蛋白質中不連續的部分，無法用多肽免疫技術產生。

為了獲得特異性的針對多跨膜區整合膜蛋白的抗體，一些研究嘗試了將純化的蛋白嵌入到脂質體中，或者直接使用含有目的蛋白的細胞膜為抗原來制備抗體。但是上述兩種方案中，目標蛋白的濃度往往很低，很難獲得目標抗體。

發明內容

本發明的目的在于提供一種人工生物膜系統以及制備方法和應用。

本發明人通過用脂立方相克服了以上缺點，本發明人認為，這是因為：1）脂立方相中在多跨膜區膜蛋白濃度高；2）脂立方相提供了多跨膜區整合膜蛋白結構完整性所需的膜環境。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

本發明的一個目的是提供一種人工生物膜系統，其為含有膜蛋白的脂立方相，所述膜蛋白為鈉葡萄糖蛋白。

具體地，所述鈉葡萄糖蛋白為人鈉葡萄糖蛋白。

更具體地，所述人鈉葡萄糖蛋白為SGLT1或SGLT2。

優選地，所述人鈉葡萄糖蛋白為人SGLT2的氨基酸序列第10位到第672位組成的蛋白（SEQ ID NO：1）。

具體地，所述脂立方相包括甘油酯和磷脂。

更具體地，所述脂立方相包括油酸甘油酯和磷脂A。

本發明的另一個目的是提供一種所述的人工生物膜系統的制備方法，包括如下步驟：

步驟（1）、根據鈉葡萄糖蛋白的氨基酸序列設計合成適合酵母表達的DNA序列；

步驟（2）、將所述的DNA序列全基因合成到表達質粒中；

步驟（3）、將所述的表達質粒在酵母細胞中表達、分離、純化得到合成的鈉葡萄糖蛋白溶液；

步驟（4）、將所述的脂立方相的原料與步驟（3）合成的鈉葡萄糖蛋白溶液混合形成所述的人工生物膜系統。

優選地，步驟（1）中，在所述鈉葡萄糖蛋白的氨基酸序列的氮末端添加用于蛋白的親和純化的多個連續的組氨酸序列、用于酶聯免疫的FLAG 表位序列、用于去除所述的組氨酸序列和所述的FLAG 表位序列的TEV酶切位點序列，然后設計合成適合酵母表達的DNA序列。

進一步優選地，所述的FLAG 表位序列為DYKDDDK；所述的TEV酶切位點序列為NLYFQGS。