[發明專利]牛呼吸道合胞體G蛋白特異性核酸適配體

有效

• 申請號: 201711177745.5
• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN107858357B
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 王真;曹莉;王家偉;魯琳
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;G01N33/569
• 代理公司: 長沙星耀專利事務所(普通合伙) 43205
• 代理人: 許伯嚴

本發明涉及一種牛呼吸道合胞體G蛋白特異性核酸適配體、其應用及其篩選方法，屬于生物工程領域。本發明通過微孔板法不同輪次篩選獲得多條G蛋白的核酸適配體候選物，選擇測序結果出現頻次較高的適配體，用I?ELAA法測定了其與G蛋白的結合力，五條適配體G?6、G?13、G?39、G?55和G?72的KD值分別為34.17±2.1nM、28.33±2.07nM、48.09±1.05nM、32.06±2.27nM和25.27±1.34nM，二級結構預測顯示核酸適配體均具有穩定的頸環狀或發卡狀結構，說明本次篩選的五條適配體均能與G蛋白特異、穩定的結合，可用于后續檢測牛呼吸道合胞體抗原或抗體的酶聯適配體法的建立。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種牛呼吸道合胞體G蛋白特異性核酸適配體。

背景技術

指數富集配體系統進化技術(Systematic evolution of ligand byexponential enrichment,SELEX)是一種能獲取與靶物質特異結合的寡核苷酸的篩選技術，篩選得到的單鏈DNA或RNA分子稱為核酸適配體。核苷酸不僅有儲存和傳遞遺傳信息的作用，還可以通過自身特有的空間結構與其它分子相互作用。在適宜條件下，單鏈DNA或RNA分子會發生適應性折疊，形成發夾、凸環、四分體等結構，從而與靶物質緊密結合。因此，近年來，具有高特異性、高親和力、高穩定性、低免疫原性、低分子量、易于合成等特點的核酸適配體，得到了廣泛的應用。微孔板法是將靶分子通過物理吸附作用結合于微孔板上，加入適配體文庫孵育后棄去未結合的適配體，洗脫與靶分子結合的適配體即可；該方法適用靶分子廣，對靶分子性狀要求不嚴格，凡是能特吸附至微孔板的物質均可進行篩選。然而，對于不同的靶物質應采用適當的篩選方法，以便快速、準確地篩選到親和力高、特異性強的適配體。

牛呼吸道合胞體病是由牛呼吸道合胞體病毒(bovine respiratory syncytialvirus，BRSV)引起的一種急性、熱性呼吸道傳染病。該病能影響犢牛的生長發育，可使肉牛增重減緩及乳牛泌乳量顯著下降，15-18月齡牛發病率高達80％-100％，在一些牛場急性感染牛的死亡率可達20％。BRSV可通過再次感染或攜帶者在畜群中持續存在，使其治療費用不斷增加，給養牛業造成了重大的經濟損失。牛呼吸道合胞體病的早期準確診斷，不但能夠減少經濟損失，而且可以有效的控制該病的發生和蔓延，具有長遠的社會效益。要保證養牛業快速、健康、穩定的發展，就要加強對該病的診斷和防制。因此，建立一種低成本同時具有較高的敏感性和特異性的適合中國國情的牛呼吸道合胞體病診斷方法對養牛業甚至是畜牧業的發展具有很重要的意義。

牛呼吸道合胞體G蛋白為N-和O-糖基化的II型糖蛋白，含有257個氨基酸，包括N-端的胞漿區、疏水的錨定區和外功能區。G蛋白是病毒主要的吸附蛋白，抗G蛋白的特異性抗體可以阻止病毒與細胞的結合，同時G蛋白也是牛呼吸道合胞體病毒的主要保護性抗原之一。為了得到牛呼吸道合胞體G蛋白高結合力和特異性的核酸適配體，我們采用了較為傳統的微孔板法，進行了改進和優化。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種具有高度特異性、分子量小、化學性質穩定、易于保存和標記的可用于識別牛呼吸道合胞體G蛋白的核酸適配體，還相應地提供所述核酸適配體的篩選方法與應用。對牛呼吸道合胞體核酸適配體篩選方法進行改進和優化，該篩選方法具有適用靶分子廣，對靶分子要求不嚴格，操作簡便，節約成本等優點。同時運用該方法篩選獲得的G蛋白核酸適配體，為后續檢測牛呼吸道合胞體抗原或抗體的酶聯適配體法的建立奠定了基礎。

本發明采用如下技術方案：

牛呼吸道合胞體G蛋白核酸適配體篩選方法，包括如下步驟：

步驟一：設計和合成初始寡核苷酸文庫及用于PCR擴增的上游引物和下游引物；

步驟二，包被：吸取G蛋白溶液包被于微孔板中；

步驟三，洗板：甩去包被液，洗滌微孔板，甩干；