[發(fā)明專利]一種鑒定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的試劑以及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711177591.X
• 申請日: 2017-11-23
• 公開（公告）號: CN107937606B
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 譚理琦;鄭曉聰;秦智鋒;李汶松;蔡良語;盧奕良;王津津;孫潔;林彥星;馬嵐;鐘松清;劉建利;劉葒;蘭文升
• 申請（專利權）人: 深圳市福田區(qū)動物防疫監(jiān)督所;深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京華夏泰和知識產權代理有限公司 11662
• 代理人: 姚金金

本發(fā)明涉及獸醫(yī)病原微生物檢測技術領域，公開了一種鑒定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的試劑以及方法。本發(fā)明所述試劑由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物、SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物、在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列上修飾有熒光基團1和淬滅基團的狂犬病毒疫苗株探針和在SEQ ID NO:4所示核苷酸序列上修飾有熒光基團2和淬滅基團的狂犬病毒野生型毒株探針組成。本發(fā)明提供了一組具備較高特異性和靈敏度的引物和探針試劑，通過所述試劑實現(xiàn)了準確鑒定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的目的，彌補了現(xiàn)有一般病毒分離，血清學試驗，RT?PCR等方法較難區(qū)分野毒株與疫苗株的缺陷，可全面應用于狂犬病毒疫苗的安全性評價以及臨床診斷中。

技術領域

本發(fā)明涉及獸醫(yī)病原微生物檢測技術領域，具體涉及一種鑒定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的試劑以及方法。

背景技術

狂犬病毒(Rabies virus,RV)屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒屬(Lyssavirus)。外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜，內含有單鏈RNA，是引起狂犬病的病原體。

狂犬病毒G蛋白是唯一可誘導機體產生中和抗體進行體液免疫的病毒結構蛋白，以前的研究已經(jīng)確定G蛋白幾個空間表位和線性表位。G基因編碼524個氨基酸(AA)，在肽鏈的氨基端，前19個殘基為信號肽，在成熟過程中，信號肽被切除，變?yōu)楹?05個AA的成熟G蛋白。它分為三個區(qū)域：膜外區(qū)，即抗原區(qū)(1～439AA)，位于病毒顆粒的表面；跨膜區(qū)(440～461AA)，由23個AA組成連續(xù)的疏水區(qū)域，與G蛋白在病毒的脂雙層膜上的固定有關；膜內區(qū)(462～505AA)，由44個AA構成的羧基末端，位于病毒包膜的內表面，提供M和N相互作用的位點。

膜外區(qū)是G蛋白抗原性的主要區(qū)域，在該區(qū)域內，至少已確定有6個抗原表位，其中抗原位點Ⅱ和III最重要，抗原位點Ⅱ保守，由第34～42和第198～200位AA殘基通過二硫鍵連接形成，它們受147和184位點AA殘基的影響；抗原位點III也是由兩個非連續(xù)區(qū)域構成，即330～338和357AA殘基；表位I由23l位AA殘基參與；表位Ⅳ由264位AA殘基參與；表位V由254～275AA殘基組成，是一個線性表位，在目前所測序的毒株中均保守，LHKFRSDE是其核心序列，L被P、Q或V及D被更小的氨基酸A、G取代后，可明顯增強與單抗的結合效果，說明D有空間位阻效應。抗原位點a(minor site“a”)位于342～343位AA殘基。在抗原位點III最關鍵和最易變化的AA在第333,336,338和357位，在抗原位點II是第198位AA上，它們不僅是病毒的中和抗原決定簇，是病毒中和抗體的主要結合部位，而且與病毒的感染和毒力直接相關，其中，第333位的精氨酸往往隨著固定毒株致病性的失去而被異亮氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代。

在1990年，Dietzschold等人在ERA株上的G蛋白244～281位AA殘基位點發(fā)現(xiàn)一個線性表位。然而，在1995年，Ni等人在幾個實驗室毒株發(fā)現(xiàn)，位于249和268位AA殘基位點之間的序列構成一個線性表位，而且263位點的Phe是識別RG719單克隆抗體的必需AA殘基。因此，狂犬病毒G蛋白第333位精氨酸往往隨著野毒株致病性的失去而被異亮氨酸、天冬氨酸或谷氨酸取代。

目前檢測狂犬病毒的實驗室方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、熒光抗體方法(FAT)、快速熒光抑制灶技術(RFFIT)、反轉錄－聚合酶鏈反應(RT-PCR)、熒光定量RT-PCR，基因芯片技術和恒溫擴增技術等。但是這些方法不能區(qū)分野生型毒株和疫苗株，尤其缺乏對狂犬病毒疫苗株的鑒定方法，對于疫苗的安全性評價以及臨床診斷等方面的應用存在不足，致使狂犬病毒疫苗使用存在一定的風險。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的試劑，使得所述試劑能夠準確鑒定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株，并具備較高的特異性和靈敏度；