[發(fā)明專利]一種免疫組化檢測NAP2在肝癌和癌旁組織中表達方法

在審

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• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN107907686A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發(fā)明（設計）人: 于思創(chuàng);王海云
• 申請（專利權）人: 南寧科城匯信息科技有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 南寧指北針知識產(chǎn)權代理事務所(特殊普通合伙)45120
• 代理人: 于勤,林培

技術領域

本發(fā)明涉及基因轉錄組學和蛋白質(zhì)組學領域，尤其是一種免疫組化檢測NAP2在肝癌和癌旁組織中表達的初步方法。

背景技術

由于原發(fā)性肝癌早期一般無任何癥狀，一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，病情大多已進入中、晚期，而且惡性程度高、進展快、預后差、侵襲性強，因此，尋找有效的腫瘤標志物用于癌變機理研究、藥物靶標的設計、疾病的早期診斷及高危人群的篩查成為廣西地區(qū)肝癌研究的當務之急。

目前，肝癌的發(fā)現(xiàn)和診斷是通過血清AFP檢測結合影像學檢查。其中臨床較為公認的肝癌診斷標準為：血清AFP濃度>400μｇ/L，持續(xù)4周，影像學發(fā)現(xiàn)肝臟有實質(zhì)性占位且能排除肝炎活動、生殖胚胎性腫瘤等疾病。但僅依靠血清AFP濃度來診斷肝癌，靈敏度為39%~64%之間，特異度為76%~91%，陽性預測值只在9%～32%，這就使得很多肝癌患者漏檢，或假陽性和假陰性，直接影響肝癌患者的早期診斷和治療。

隨著生物技術的迅猛發(fā)展及人類基因組計劃(HGP)全基因組測序的完成，人類進入了后基因組時代，其中蛋白質(zhì)組學的研究越來越受到人們的關注。用蛋白質(zhì)組學技術來檢測、分析和確定標志蛋白和靶蛋白，闡明腫瘤蛋白表達水平的變化與腫瘤發(fā)生發(fā)展不同階段的相互關系及其規(guī)律，是目前解決腫瘤早期診斷難題的最有利的途徑；同時，也是腫瘤及其藥物篩選研究中最新并且最強有力的手段。

質(zhì)譜技術是蛋白組學技術中篩選、鑒定特異性腫瘤標志物的核心，常用的是表面增強激光解析/離子化飛行時間質(zhì)譜技術（surface-enhanced laserdesorption/inionation-time of flightmass spectrometry，SELDI-TOF-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）。本課題組曾利用SELDI-TOF-MS結合液質(zhì)聯(lián)用HPLC/MALDI-TOF-MS技術對乙肝相關的肝癌、慢性良性肝病、正常人的血清樣品進行分析，得到人類乙肝相關肝癌的特異性血清標志物NAP2（71）和NAP2（73）。利用與SELDI有著相似的檢測原理但重復性較好的CLINPROT系統(tǒng)，在肝癌與正常人兩組血清樣品中篩選到兩個差異明顯的蛋白質(zhì)多肽，一個鑒定為來自纖維蛋白原（Fibrinogen）的一個分泌片段，纖維蛋白肽A（Fibrinopeptide A），這與Eduard等的結果完全一致；另一個多肽鑒定為激肽原（Kininogen）。而近兩年來新發(fā)展的iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）標記結合MALDI-TOF MS/MSF技術，建立在iTRAQ同位素標記試劑的基礎上，包括一個帶電荷的報告基團，另外還有一個肽段反應基團和一個平衡基團，其中平衡基團平衡分子量，保證與每一種報告基因結合后iTRAQ試劑總的相對分子量都是145，肽段反應基團可以同肽段的N末端和賴氨酸測量E氨基基團發(fā)生反應，這樣可以標記生物樣品中產(chǎn)生的所有肽段，增強任一給定蛋白的肽段覆蓋度，同時保留了諸如一些蛋白的翻譯后修飾的重要結構信息，為疾病標志物的發(fā)現(xiàn)與鑒定提供了定量信息，使得課題組在肝癌新標志物的篩選方面更為如虎添翼。

自2005年起，本課題組經(jīng)上述質(zhì)譜技術篩選肝癌特異性標志物，取得的一系列研究成果，這些功能蛋白質(zhì)和潛在疾病蛋白質(zhì)標志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定得益于差異蛋白質(zhì)組學研究的發(fā)展，但如何進一步探測這些蛋白質(zhì)的表達豐度，以闡明其功能和在疾病研究中的意義，已變得越來越重要。目前，標志物發(fā)現(xiàn)- 驗證- 臨床確證的研究模式已得到研究者們的廣泛認可。即在發(fā)現(xiàn)階段從疾病生物樣本中尋找與正常樣本有差異的蛋白質(zhì)；到驗證階段對篩選出來的標記物定量，評估其準確性、特異性、范圍等，并把被驗證的標志物與臨床特征、結果相聯(lián)系；將驗證階段找出的最有可能成為生物標志物的候選分子，進入下一步臨床確證。這種研究模式使體液中生物標志物的發(fā)現(xiàn)和驗證更為有效、科學和合理。