[發明專利]鑒別中華絨螯蟹的分子特異性標記引物及方法

在審

• 申請號: 201711174930.9
• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN107841565A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 崔海月;耿小燕;張繼敏;蔣壽佳;游欣欣;王敏
• 申請（專利權）人: 鎮江華大檢測有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 徐冬濤,李曉峰

技術領域

本發明涉及一種鑒別中華絨螯蟹的分子特異性標記引物，以及一種利用該特異引物對中華絨螯蟹標本快速鑒別的方法。

背景技術

中華絨螯蟹(學名：Eriocheir sinensis)棲于淡水湖泊河流。每年6至7月間新生幼蟹溯河進入淡水后，棲于江河、湖蕩的岸邊。喜掘穴而居，或隱藏在石礫、水草叢中。掘穴時主要靠1對螯足，步足只起輔助作用。以水生植物、底棲動物、有機碎屑及動物尸體為食。取食時靠螯足捕捉，然后將食物送至口邊。營養條件好時，當年幼蟹體重可達50至70克，最大可達150克，且性腺成熟，可與2齡蟹一起參加生殖洄游。如放養密度大或生長慢，則2齡時性腺也難以成熟，不能參加生殖洄游。目前，對中華絨螯蟹的物種識別僅局限于形態學鑒定，而且專業鑒定人員很少。由于長江上游水壩修筑導致產卵地遭到破壞；加之外來物種的入侵及水體污染導致中華絨螯蟹的生存環境遭受嚴重破壞，所以中華絨螯蟹的種群數量日益下降。因此，對中華絨螯蟹地方特有種進行有效鑒定以及物種保護已經刻不容緩。

DNA條形碼技術(DNA barcoding)是指用基因組內一段標準的、短的DNA片段來鑒定物種的一項分子鑒定新技術，可以快速、準確的進行物種鑒定。DNA條形碼具有廣泛的應用前景，在物種鑒定、分子進化、種群遺傳、瀕危物種保護等研究領域具有一定的發展潛力。DNA條形碼不同于以往的傳統鑒別方法，對研究人員的專業技能并無較高要求，上至生物學家，下至普通生物愛好者，都可在短時間內掌握該技術。DNA條形碼技術擺脫了傳統形態鑒定方法依賴長期經驗的障礙，可實現快速準確的鑒定，是分子鑒定方法學上的創新，操作簡單、效率高、應用廣等特點無疑將改變整個物種鑒定領域的發展方向。運用DNA條形碼技術，可以很好的對中華絨螯蟹進行快速、有效的鑒定。

物種鑒定一直是分類學乃至幾乎所有生物領域上的研究至關重要的基礎步驟。因此，準確的對物種鑒定，特別是對那些稀有物種和具有保護意義的種類，分類鑒定工作就顯得尤其重要。

發明內容

本發明的一個目的是針對現有技術的不足，提供了一種用于鑒別中華絨螯蟹的分子特異性標記引物及其應用。

本發明的另一目的在于提供一種快速鑒別中華絨螯蟹的方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一種用于鑒別中華絨螯蟹的分子特異性標記引物，該引物的核苷酸序列如下：

上游引物PXF:5’-ACTTGGTGGTTTAAACTTAACCC-3’；

下游引物PXR:5’-ATTGAATTAGTATAGAAAGGGAG-3’。

該對分子特異性引物是采用普通PCR技術，經過對中華絨螯蟹標本的核糖體ITS區序列的克隆序列，然后通過NCBI的序列比對設計的，上述引物具有極高的專一性，用此對引物進行PCR擴增，可以獲得200bp左右的特異性片段。

本發明還涉及上述的分子特異性標記引物(PXF/PXR)在鑒別中華絨螯蟹中的應用。

本發明還涉及上述的分子特異性標記引物在制備用于鑒別中華絨螯蟹的試劑盒中的應用。

一種用于鑒別中華絨螯蟹的試劑盒，該試劑盒中包含上述的分子特異性標記引物。該試劑盒中還包含PCR常用試劑。

一種快速鑒別中華絨螯蟹的方法，以待測樣本的基因組DNA為模板，以上述的分子特異性標記引物(PXF/PXR)作為擴增引物進行PCR擴增，對擴增產物進行電泳檢測：如果電泳結果出現DNA目的條帶，則待測樣本為中華絨螯蟹。所述的DNA目的條帶為200±10bp的DNA目的條帶。

上述PCR擴增的反應程序為：94℃變性5min；94℃、30s，48℃、30s，72℃、1min，35個循環；72℃延伸10min。

上述方法中擴增的選擇、基因組DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定，以及電泳檢測，這些步驟均可按照本領域常規方法進行。

需要說明的是，本發明分子特異性標記引物和檢測方法僅適用于中華絨螯蟹的形態學特征初步的判斷，再將判斷為中華絨螯蟹的標本運用本發明方法鑒別。

對本發明所述快速鑒別中華絨螯蟹方法進行驗證的具體步驟如下：

(1)從浸泡標本中剪取中華絨螯蟹的部分肌肉組織，保存在95％酒精中于-20℃冰箱中存放。

(2)生物公司試劑盒方法提取樣品中的基因組DNA，于-20℃保存備用。

(3)以步驟(2)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物(PXF/PXR)作為擴增引物，進行PCR擴增：

PCR反應體系(總體積為25μL)組成為：