[發(fā)明專利]鑒別鯰魚的分子特異性標記引物及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711173774.4
• 申請日: 2017-11-22
• 公開（公告）號: CN107841563A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發(fā)明（設計）人: 崔海月;張繼敏;蔣壽佳;游欣欣;石瓊;馬興宇
• 申請（專利權）人: 鎮(zhèn)江華大檢測有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司32218
• 代理人: 徐冬濤,李曉峰

技術領域

本發(fā)明涉及一種鑒別鯰魚的分子特異性標記引物，以及一種利用該特異引物對鯰魚標本快速鑒別的方法。

背景技術

鯰魚(學名：Silurus asotus)鯰魚，動物界-脊索動物門-脊索動物亞門-輻鰭魚綱-鯰形目-鯰科-鯰屬-鯰魚種。鯰魚同類幾乎是分布在全世界，多數(shù)種類是生活在池塘或河川等的淡水中，但部分種類生活在海洋里。普遍的體上沒有鱗，有扁平的頭和大口，口的周圍有數(shù)條長須，利用此須能辨別出味道，這是它的特征。目前，對鯰魚的物種識別僅局限于形態(tài)學鑒定，而且專業(yè)鑒定人員很少。由于長江上游水壩修筑導致產(chǎn)卵地遭到破壞；加之外來物種的入侵及水體污染導致鯰魚的生存環(huán)境遭受嚴重破壞，所以鯰魚的種群數(shù)量日益下降。因此，對鯰魚地方特有種進行有效鑒定以及物種保護已經(jīng)刻不容緩。

DNA條形碼技術(DNAbarcoding)是指用基因組內(nèi)一段標準的、短的DNA片段來鑒定物種的一項分子鑒定新技術，可以快速、準確的進行物種鑒定。目前在動物中最常見的分子標記是線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome coxidase I,COI)基因的部分序列。DNA條形碼具有廣泛的應用前景，在物種鑒定、分子進化、種群遺傳、瀕危物種保護等研究領域具有一定的發(fā)展?jié)摿ΑNA條形碼不同于以往的傳統(tǒng)鑒別方法，對研究人員的專業(yè)技能并無較高要求，上至生物學家，下至普通生物愛好者，都可在短時間內(nèi)掌握該技術。DNA條形碼技術擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法依賴長期經(jīng)驗的障礙，可實現(xiàn)快速準確的鑒定，是分子鑒定方法學上的創(chuàng)新，操作簡單、效率高、應用廣等特點無疑將改變整個物種鑒定領域的發(fā)展方向。運用DNA條形碼技術，可以很好的對鯰魚進行快速、有效的鑒定。

物種鑒定一直是分類學乃至幾乎所有生物領域上的研究至關重要的基礎步驟。因此，準確的對物種鑒定，特別是對那些稀有物種和具有保護意義的種類，分類鑒定工作就顯得尤其重要。自從2003年，加拿大科學家Hebert提出以COI基因做為DNA條形碼以來，越來越多的研究表明DNA條形碼在物種分類上具有高效可行性。大量的研究結果顯示以COI基因為標記的DNA條形碼能夠準確的對各類動物進行物種鑒定，可以選用COI基因作為各種動物條形碼數(shù)據(jù)庫的標準條形碼。

該方法與傳統(tǒng)的分類學方法互為佐證，不僅可以解決鑒定中標本殘缺不全無法準確鑒定等問題，而且有利于快速鑒定。目前已有專門的魚類數(shù)據(jù)庫，其中包括1.5萬多種魚類的條形碼數(shù)據(jù)。但是我國許多魚類由于其特有性，沒有足夠的相關數(shù)據(jù)。也沒有鯰魚的相關基因序列。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供了一種用于鑒別鯰魚的分子特異性標記引物及其應用。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒別鯰魚的方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)：

用于鑒別鯰魚的分子特異性標記引物，該引物的核苷酸序列如下：

上游引物NYF:5’-TTGCCCACGCAGGAGCT-3’；

下游引物NYR:5’-CTGTAATTAGTACGGCTCAT-3’。

該對分子特異性引物是采用普通PCR技術，經(jīng)過對鯰魚標本的核糖體ITS區(qū)序列的克隆序列，然后通過NCBI的序列比對設計的，上述引物具有極高的專一性，用此對引物進行PCR擴增，可以獲得170bp左右的特異性片段。

本發(fā)明還涉及上述的分子特異性標記引物(NYF/NYR)在鑒別鯰魚中的應用。

本發(fā)明還涉及上述的分子特異性標記引物在制備用于鑒別鯰魚的試劑盒中的應用。

一種用于鑒別鯰魚的試劑盒，該試劑盒中包含上述的分子特異性標記引物。該試劑盒中還包含PCR常用試劑。

一種快速鑒別鯰魚的方法，以待測樣本的基因組DNA為模板，以上述的分子特異性標記引物(NYF/NYR)作為擴增引物進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測：如果電泳結果出現(xiàn)DNA目的條帶，則待測樣本為鯰魚。上述的DNA目的條帶為170±10bp的DNA目的條帶。

上述PCR擴增的反應程序為：94℃變性5min；94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

上述方法中擴增的選擇、基因組DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定，以及電泳檢測，這些步驟均可按照本領域常規(guī)方法進行。

需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標記引物和檢測方法僅適用于鯰魚的形態(tài)學特征初步的判斷，再將判斷為鯰魚的標本運用本發(fā)明方法鑒別。

對本發(fā)明所述鑒別鯰魚方法進行驗證的具體步驟如下：