[發(fā)明專利]一種基于淺層液體培養(yǎng)的麝香百合遺傳轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711172159.1
• 申請(qǐng)日: 2017-11-22
• 公開（公告）號(hào): CN107881194B
• 公開（公告）日: 2020-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 席夢(mèng)利;趙乙璉;孫惠霖;姜珊;施季森
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;C12N1/20;A01H5/00;A01H6/56
• 代理公司: 32231 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 陳麗萍

1.一種基于淺層液體培養(yǎng)的麝香百合遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)預(yù)培養(yǎng)：剝?nèi)“俸稀咨健袑喻[片，無(wú)菌條件下用解剖刀縱切成0.4-0.6mm厚度的薄切片，放入預(yù)培養(yǎng)基，于暗培養(yǎng)箱中25℃條件下暗培養(yǎng)4d，得到預(yù)培養(yǎng)后的外植體；

(2)菌株活化：從LB培養(yǎng)基平板上挑取根癌農(nóng)桿菌的單菌落接種至含鏈霉素30.0mg/L和卡那霉素50.0mg/L的10mL LB液體培養(yǎng)基中，置于220r/min的搖床上，28℃條件下過夜培養(yǎng)19h，得到根癌農(nóng)桿菌懸液，將根癌農(nóng)桿菌懸液1mL添加到含鏈霉素30.0mg/L和卡那霉素50.0mg/L的LB液體培養(yǎng)基以1∶50的比例在220r/min的搖床上，28℃震蕩培養(yǎng)4h至OD600為0.6，得到活化菌液，將活化菌液在4℃下以5000r/min的速度進(jìn)行離心10min收集菌體，抽棄上清，加入不含NH4NO3但添加毒莠定4.0mg/L和乙酰丁香酮100mg/L的液體MS0培養(yǎng)基，在渦旋儀上以150r/min的速度旋渦，得到重懸菌液，重懸菌液的OD600為0.4；

(3)農(nóng)桿菌侵染與共培養(yǎng)：將預(yù)培養(yǎng)后的外植體放入OD600為0.4的重懸菌液中進(jìn)行侵染，時(shí)間為10min，侵染過程中輕輕搖晃，侵染后取出外植體放置于無(wú)菌濾紙吸干菌液，再將外植體放到共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)7d，得到共培養(yǎng)后的外植體；

(4)脫菌與篩選培養(yǎng)：共培養(yǎng)后的外植體放入含頭孢霉素200mg/L的液體MS0培養(yǎng)基的三角瓶中，輕輕搖晃1min后，取出外植體在無(wú)菌濾紙吸干液體后再放入含有毒莠定4.0mg/L、卡那霉素50mg/L和頭孢霉素100mg/L的液體MS0培養(yǎng)基中用手輕輕搖晃，取出薄切片在無(wú)菌濾紙上吸干液體，吸干液體后將薄切片放入篩選培養(yǎng)基中，在溫度為25℃，濕度為50％～60％，光強(qiáng)為2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光培養(yǎng)箱中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，24d為一個(gè)周期，進(jìn)行兩個(gè)周期的篩選，得到篩選后的外植體；

(5)分化與抗性苗的獲得：將篩選后的外植體轉(zhuǎn)移至裝有增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在溫度為25℃，濕度為50％～60％，光強(qiáng)為2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1個(gè)月?lián)Q一次新鮮的MS0培養(yǎng)基同時(shí)剔除已經(jīng)褐化的外植體，轉(zhuǎn)化進(jìn)行至4-6個(gè)月會(huì)有小苗形成，將小苗轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基中，在溫度25℃，濕度為50％～60％，光強(qiáng)為2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，去除褐化小苗，得到轉(zhuǎn)化植株；

(6)體視熒光顯微鏡觀察檢測(cè)：將轉(zhuǎn)化植株的葉片置于體視熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)抗性植株在紫外條件下有綠色熒光；所述步驟(1)中預(yù)培養(yǎng)基為液體MS0培養(yǎng)基+毒莠定4.0mg/L，pH為5.8；所述步驟(2)中根癌農(nóng)桿菌的菌株為EHA105，質(zhì)粒pBI121，載體中含有Npt II選擇基因，GFP報(bào)告基因；所述步驟(2)中LB培養(yǎng)基的配方：胰蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+氯化鈉10g/L+瓊脂11.5g/L，pH為7.0；所述步驟(3)中共培養(yǎng)基為不含NH4NO3的液體MS0培養(yǎng)基+毒莠定4.0mg/L+乙酰丁香酮100mg/L，pH為5.8。

2.如權(quán)利要求1所述的一種基于淺層液體培養(yǎng)的麝香百合遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(4)中篩選培養(yǎng)基為液體MS0培養(yǎng)基+毒莠定4.0mg/L+卡那霉素50mg/L+頭孢霉素100mg/L，pH為5.8。

3.如權(quán)利要求1所述的一種基于淺層液體培養(yǎng)的麝香百合遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟(5)中增殖培養(yǎng)基為固體MS0培養(yǎng)基，pH為5.8。

4.如權(quán)利要求1所述的一種基于淺層液體培養(yǎng)的麝香百合遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基為瓶裝固體MS0培養(yǎng)基+卡那霉素50mg/L+頭孢霉素100mg/L，pH為5.8。