[發(fā)明專利]接種菌劑玉米的根際原核微生物多樣性檢測方法

在審

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• 申請日: 2017-11-21
• 公開（公告）號: CN109811044A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周培;初少華;張丹;支月娥;王斌;戚志萍
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 上海交達(dá)專利事務(wù)所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

一種接種菌劑玉米的根際原核微生物多樣性檢測方法，通過從種植有玉米幼苗的根際土壤中提取宏基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增其中的16SrDNA的V4V5高變區(qū)片段以構(gòu)建文庫；經(jīng)過雙端測序后進(jìn)行分類學(xué)單元分類，與文庫進(jìn)行對比和注釋，最后通過根際土壤原核微生物的群落結(jié)構(gòu)分析，比較不同處理之間的異同，具體為：Alpha多樣性分析、分類學(xué)組成分析和Beta多樣性分析，得到微生物群體分類。本發(fā)明為巨大芽孢桿菌菌劑對根際土壤原核微生物群落影響的準(zhǔn)確評估提供了一種新方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種土壤微生物檢測領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種基于16S rDNA高通量測序檢測施加巨大芽孢桿菌菌劑的玉米根際原核微生物多樣性的方法。

背景技術(shù)

根際微生物指在植物根系周圍，受根系生長影響的土體中的微生物。根際微生物同土壤和植物根際相互作用，能夠直接影響土壤的生物化學(xué)活性、土壤養(yǎng)分的組成和轉(zhuǎn)化以及植物的生長。因此，根際微生物多樣性是土壤理化性質(zhì)的重要生物指標(biāo)之一。研究植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)能夠反映土壤肥力高低，從而揭示施加微生物菌劑對植物根際微環(huán)境的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)檢測通量低、規(guī)模小、精確度低、覆蓋度低等不足，，提出一種玉米根際原核微生物多樣性檢測方法，利用了16SrDNA高通量測序技術(shù)憑借低成本、高通量、流程自動(dòng)化的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)菌劑對根際土壤原核微生物群落影響的準(zhǔn)確評估。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明涉及一種接種菌劑玉米的根際原核微生物多樣性檢測方法，通過從種植有玉米幼苗的根際土壤中提取宏基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增其中的16SrDNA的V4V5高變區(qū)片段以構(gòu)建文庫；經(jīng)過雙端測序后進(jìn)行分類學(xué)單元(OTU)分類，與文庫進(jìn)行對比和注釋，最后通過根際土壤原核微生物的群落結(jié)構(gòu)分析，比較不同處理之間的異同，具體為：Alpha多樣性分析、分類學(xué)組成分析和Beta多樣性分析，得到微生物群體分類。

所述的宏基因組DNA，采用OMEGA Soil DNA Kit試劑盒提取得到。

所述的土壤，其中含有不同硝態(tài)氮濃度且施加有巨大芽孢桿菌NCT-2菌劑；

所述的土壤，優(yōu)選在種植有玉米幼苗35天后將玉米植株連根從土中取出，用抖根法收集根際土，混合均勻并去除根毛，于-80℃保存。

所述的巨大芽孢桿菌NCT-2菌劑，通過將58.9％的巨大芽孢桿菌NCT-2發(fā)酵液與23.5％的秸稈粉和17.6％的葡萄糖混勻得到。

所述的不同硝態(tài)氮濃度，采用但不限于：22mg/kg、72mg/kg、122mg/kg；優(yōu)選以高溫滅菌的巨大芽孢桿菌NCT-2制成對比菌劑，即N1號菌劑：含NCT-2菌劑2+22mg/kg硝態(tài)氮、N2號菌劑：含NCT-2菌劑且配有72mg/kg硝態(tài)氮、N3號菌劑：含NCT-2菌劑且配有122mg/kg硝態(tài)氮、S1號菌劑：含NCT-2滅菌菌劑且配有22mg/kg硝態(tài)氮、S2號菌劑：含有NCT-2滅菌菌劑且配有72mg/kg硝態(tài)氮、S3號菌劑：含NCT-2滅菌菌劑且配有122mg/kg硝態(tài)氮。

所述的巨大芽孢桿菌NCT-2保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.4698。；

所述的秸稈粉取自水稻秸稈，經(jīng)粉碎后長度小于0.5cm且含水率低于20％。

所述的混勻是指：混合后的菌劑隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)的樣品檢測葡萄糖含量，各點(diǎn)之間的葡萄糖含量應(yīng)無顯著差異。

所述的PCR擴(kuò)增，選用特異性引物515F，如Seq ID No.1所示和907R，如Seq IDNo.2所示分別作為前引物和后引物做PCR擴(kuò)增所述宏基因組DNA中16SrDNA的V4V5高變區(qū)片段以構(gòu)建文庫；