[發(fā)明專利]一種單鏈TCR?T載體及單鏈TCR?T細(xì)胞生產(chǎn)工藝

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711163800.5
• 申請(qǐng)日: 2017-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN107881185A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳銳;李思;房晉旭;于海禮;吳海陽(yáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶天科雅生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 重慶上義眾和專利代理事務(wù)所(普通合伙)50225
• 代理人: 孫人鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及TCR-T類免疫治療技術(shù)及應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)

TCR-T技術(shù)是通過(guò)人工改造自體T細(xì)胞使其表達(dá)腫瘤抗原特異性TCR的細(xì)胞治療技術(shù)。TCR-T細(xì)胞治療包括腫瘤特異性TCR的選取、TCR表達(dá)載體的構(gòu)建、TCR-T改造后細(xì)胞回輸、免疫進(jìn)程監(jiān)測(cè)等關(guān)鍵技術(shù)和治療手段。與同類型的CAR-T(嵌合抗原受體T細(xì)胞)細(xì)胞治療技術(shù)相比，TCR-T具有更廣泛抗原選擇空間，因此不僅能擴(kuò)充其適用腫瘤范圍，還有望減少脫靶效應(yīng)[1]。然而，盡管TCR-T在臨床前測(cè)試和小范圍病人治療中取得了一定成功[2,3]，TCR-T的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)仍然匱乏。同時(shí)，由于TCR-T的研發(fā)仍在初級(jí)階段，臨床治療品質(zhì)的TCR-T的載體構(gòu)建和細(xì)胞生產(chǎn)策略還有待改進(jìn)，更重要的是，TCR-T的有效患者人群以及新型構(gòu)造的TCR-T的臨床治療效果仍有待證實(shí)。

HPV病毒是一種人群感染率十分普遍的DNA病毒。HPV感染會(huì)造成粘膜上皮細(xì)胞增生，而高危型HPV感染會(huì)引發(fā)頭頸癌、宮頸癌等病變。有報(bào)告指出，15-25％的頭頸癌和幾乎所有的宮頸癌都由HPV感染引起[4]。目前這類癌癥的治療方案較為單一，主要治療手段包括放療和順柏類化療藥物。由于缺乏特征性突變，并沒(méi)有針對(duì)HPV癌癥的靶向藥物。因此，研發(fā)HPV引起的頭頸癌、宮頸癌的新型治療方案有非常重要的臨床意義。由于這類腫瘤有明確的HPV抗原表達(dá)譜，針對(duì)HPV抗原的主要TCR序列在過(guò)往的研究中已被闡明[5]，同時(shí)HPV抗原并無(wú)在正常組織中的表達(dá)，因此HPV特異性的TCR-T細(xì)胞將能夠安全且有效的治療HPV引發(fā)的頭頸癌、宮頸癌。

TCR-T的細(xì)胞治療方案包括以下幾個(gè)核心技術(shù)難點(diǎn)：1)TCR的選??；2)TCR-T載體的構(gòu)建；3)TCR-T的制備和回輸。在TCR-T載體構(gòu)建方面，國(guó)際上并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。目前已在進(jìn)行中的TCR-T臨床試驗(yàn)采用完整TCRα鏈和β鏈的表達(dá)載體[2,3]，但是該載體序列較長(zhǎng)，在檢測(cè)TCR是否成功導(dǎo)入T細(xì)胞時(shí)需使用特殊的多肽-MHC四聚體，會(huì)一定程度影響TCR-T的表達(dá)和質(zhì)量監(jiān)測(cè)。最后，現(xiàn)有的TCR-T技術(shù)在病人T細(xì)胞中直接導(dǎo)入外源TCR，但是未有效限制外源TCR與內(nèi)源TCR的錯(cuò)配情況。錯(cuò)配將有可能產(chǎn)生非特異性TCR識(shí)別，一旦有少量細(xì)胞識(shí)別自身抗原并克隆增殖，則會(huì)造成大規(guī)模的自體免疫反應(yīng)，在臨床中會(huì)有極大的安全風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種單鏈TCR-T載體及單鏈TCR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝。

本發(fā)明目的之一是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種單鏈TCR-T載體，其特征在于：

(1)含有，但不限于針對(duì)HLA-A2呈遞的HPV-16E6多肽的單鏈TCR序列，包括細(xì)胞膜定向信號(hào)肽序列SEQ ID No.1、TCRα鏈的可變區(qū)Vα序列SEQ ID No.2以及TCRβ鏈的可變區(qū)Vβ序列SEQ ID No.4；

(2)含有，但不限于連接TCRVα以及Vβ的連接序列SEQ ID No.3；

(4)其中，Vα與Vβ形成的單鏈TCR刪去了可變區(qū)中不識(shí)別抗原部分；

(4)含有，但不限于改造后可以形成二硫鍵的鼠源恒定區(qū)Cβ序列SEQ ID No.5以及恒定區(qū)Cα序列SEQ ID No.8；

(5)含有，但不限于用于同時(shí)表達(dá)Cβ和Cα的間隔多肽P2A序列SEQ ID No.6以及Cα部分細(xì)胞膜信號(hào)肽SEQ ID No.7。

其中，鼠源Cβ和Cα可以有效降低TCR-T與人體T細(xì)胞中的人源Cβ或者Cα錯(cuò)配，從而減少因錯(cuò)配產(chǎn)生的非HPV特異性TCR；

其中，改造后鼠源Cβ和Cα增加一處二硫鍵配對(duì)的半胱氨酸，從而進(jìn)一步促進(jìn)導(dǎo)入TCR-T的自配對(duì)，降低與人源TCR配對(duì)的可能性；

其中，鼠源Cβ和Cα含有細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)，在單鏈TCR識(shí)別抗原后可以激活T細(xì)胞下游分子通路；

該載體含有獨(dú)立的Cα部分(SEQ ID No.8)，用于支撐整個(gè)TCR結(jié)構(gòu)，同時(shí)允許僅更換Vα-Vβ-Cβ部分獲得識(shí)別其它抗原的TCR-T，從而增加該載體構(gòu)建方案的可擴(kuò)展性；

鼠源Cβ和Cα可用于免疫熒光染色方法檢測(cè)TCR-T載體的表達(dá)強(qiáng)度。

本發(fā)明目的之二是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種TCR-T細(xì)胞生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括：

(1)使用單鏈TCR-T載體、病毒結(jié)構(gòu)載體共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系；

(2)篩選產(chǎn)生高滴度的單鏈TCR-T逆轉(zhuǎn)錄病毒的單細(xì)胞；

(3)擴(kuò)增出穩(wěn)定并持續(xù)生產(chǎn)單鏈TCR-T逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒生產(chǎn)細(xì)胞系。