[發明專利]一種蓬亂蛋白1（DVL1）基因G136D突變檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201711161143.0
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107699622A
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 唐景峰;陳興珍;周策凡;胡苗;錢學紅
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

技術領域

本發明涉及生物技術及臨床分子診斷技術領域，具體涉及一種蓬亂蛋白1(DVL1)基因G136D突變檢測試劑盒。

背景技術

Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其它生理過程中，具有至關重要的作用。如果這條信號通路中的關鍵蛋白發生突變或者異常表達，導致信號異常活化，就可能誘導癌癥的發生。Wnt信號通路包括經典的Wnt信號通路與非經典的Wnt信號通路，在經典通路即Wnt-β-catenin信號通路中，Wnt因子通過激活細胞膜上的Frizzle/LRP5/6協同受體后抑制細胞內游離β-catenin蛋白的磷酸化和降解，細胞質中的β-catenin蛋白水平升高后將發生β-catenin蛋白的核移位，導致細胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能夠聯合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同與TCF/LEF-1轉錄因子家族形成復合體并激活Wnt信號通路下游靶基因的轉錄激活。

DVL1蛋白是Wnt信號通路中β-catenin上游重要成員之一。其主要作用是能夠使得GSK3β磷酸化，進而促進APC(adenomatous polyposis coli)、GSK3β、CK1復合體的降解，促進細胞質中β-catenin的入核。目前越來越多的研究已經發現，在很多腫瘤中DVL1蛋白均呈現不同程度的突變。

目前研究核心信號通路的核心分子調控機制，以及某些重要成員在細胞中的表達水平，已經成為治療腫瘤的一種關鍵手段，雖然近年來Wnt信號通路在癌癥中的研究，以及DVL1蛋白作為Wnt信號通路重要成員其突變水平的研究，已經成為研究開發腫瘤藥物急需解決的重要問題，尤其是在蓬亂特異性(Dishevelled specific domain,aa90-247)結構域中發生的突變，對DVL1蛋白發揮功能啟動非常重要的作用，例如在結直腸癌細胞中檢測出的G136D突變等。

肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠優于DNA/DNA或DNA/RNA，表現在很高的雜交穩定性、優良的特異序列識別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

本發明采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核苷酸與其靶基因結合時因電荷相互排斥所導致的雜交不穩定性，結合不易受雜交液離子強度的影響，從而顯示出極強的雜交優勢，大大提高了檢測靈敏度。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術中如何確定Wnt信號通路中核心的信號分子DVL1基因突變情況，以及如何解釋核心分子DVL1在腫瘤細胞中的突變水平變化的困難，提供了一種檢測Wnt信號通路中DVL1基因突變的試劑盒。

本發明提供的試劑盒中包括檢測DVL1基因突變的肽核酸PNA熒光探針(用于特異性檢測DVL1基因G136D突變的肽核酸熒光探針)，通過聯合肽核酸PNA熒光探針的PCR方法，能夠更加靈敏的檢測細胞中DVL1基因發生的突變，并且為研究Wnt信號通路提供最直接的證據；該試劑盒中還包括：檢測DVL1基因突變所需的與DVL1基因野生型互補雜交的一段肽核酸PNA探針(用于阻斷野生型DVL1基因擴增的肽核酸探針)、用于定性檢測DVL1基因突變的引物。

本發明的原理是通過構建與DVL1基因野生型互補的一段肽核酸PNA序列，當肽核酸PNA序列與DVL1基因互補結合時，任一突變均可導致PNA/DNA產生錯配，從而使得溶解溫度發生改變。進而根據DVL1基因突變型設計特異性的肽核酸PNA探針以及引物對DVL1突變型基因進行熒光定量PCR擴增，經過一輪的PCR擴增后，即可將DVL1基因突變型與野生型進行區分開來。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：