[發(fā)明專利]用于軸抑制蛋白（AXIN2）基因V765A突變檢測(cè)的試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201711161142.6
• 申請(qǐng)日: 2017-11-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107699621A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周策凡;唐景峰;陳興珍;胡苗;錢學(xué)紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 武漢科皓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)42222
• 代理人: 彭勁松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)及臨床分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于軸抑制蛋白(AXIN2)基因V765A突變檢測(cè)的試劑盒。

背景技術(shù)

Wnt信號(hào)通路廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中，是一類在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路。Wnt信號(hào)在動(dòng)物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其它生理過(guò)程中，具有至關(guān)重要的作用。如果這條信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變或者異常表達(dá)，導(dǎo)致信號(hào)異常活化，就可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生。Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路與非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，在經(jīng)典通路即Wnt-β-catenin信號(hào)通路中，Wnt因子通過(guò)激活細(xì)胞膜上的Frizzle/LRP5/6協(xié)同受體后抑制細(xì)胞內(nèi)游離β-catenin蛋白的磷酸化和降解，細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin蛋白水平升高后將發(fā)生β-catenin蛋白的核移位，導(dǎo)致細(xì)胞核中β-catenin蛋白升高，胞核中β-catenin蛋白能夠聯(lián)合Pygo2、Bcl-9以及FoxM1蛋白共同與TCF/LEF-1轉(zhuǎn)錄因子家族形成復(fù)合體并激活Wnt信號(hào)通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。

AXIN2蛋白是Wnt信號(hào)通路中β-catenin上游重要成員之一。其主要作用是能夠與APC(adenomatous polyposis coli)、GSK3β、CK1等蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的降解。目前越來(lái)越多的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在很多腫瘤中AXIN2蛋白均呈現(xiàn)不同程度的突變。

目前研究核心信號(hào)通路的核心分子調(diào)控機(jī)制，以及某些重要成員在細(xì)胞中的表達(dá)水平，已經(jīng)成為治療腫瘤的一種關(guān)鍵手段，雖然近年來(lái)Wnt信號(hào)通路在癌癥中的研究，以及AXIN2蛋白作為Wnt信號(hào)通路重要成員其突變水平的研究，已經(jīng)成為研究開(kāi)發(fā)腫瘤藥物急需解決的重要問(wèn)題，尤其是在PIX(aa762-841)結(jié)構(gòu)域中發(fā)生的突變，對(duì)AXIN2蛋白發(fā)揮功能啟動(dòng)非常重要的作用，例如在多種腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)出的V765A突變等。

肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)構(gòu)建并最終人工合成的第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)的形式識(shí)別并結(jié)合DNA或RNA序列，形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠(yuǎn)優(yōu)于DNA/DNA或DNA/RNA，表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異序列識(shí)別能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。

本發(fā)明采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核苷酸與其靶基因結(jié)合時(shí)因電荷相互排斥所導(dǎo)致的雜交不穩(wěn)定性，結(jié)合不易受雜交液離子強(qiáng)度的影響，從而顯示出極強(qiáng)的雜交優(yōu)勢(shì)，大大提高了檢測(cè)靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中如何確定Wnt信號(hào)通路中核心的信號(hào)分子AXIN2基因突變情況，以及如何解釋核心分子AXIN2在腫瘤細(xì)胞中的突變水平變化的困難，提供了一種檢測(cè)Wnt信號(hào)通路中AXIN2基因突變的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒中包括檢測(cè)AXIN2基因突變的肽核酸PNA熒光探針(用于特異性檢測(cè)AXIN2基因V765A突變的肽核酸熒光探針)，通過(guò)聯(lián)合肽核酸PNA熒光探針的PCR方法，能夠更加靈敏的檢測(cè)細(xì)胞中AXIN2基因發(fā)生的突變，并且為研究Wnt信號(hào)通路提供最直接的證據(jù)；該試劑盒中還包括：檢測(cè)AXIN2基因突變所需的與AXIN2基因野生型互補(bǔ)雜交的一段肽核酸PNA探針(用于阻斷野生型AXIN2基因擴(kuò)增的肽核酸探針)、用于定性檢測(cè)AXIN2基因突變的引物。

本發(fā)明的原理是通過(guò)構(gòu)建與AXIN2基因野生型互補(bǔ)的一段肽核酸PNA序列，當(dāng)肽核酸PNA序列與AXIN2基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，任一突變均可導(dǎo)致PNA/DNA產(chǎn)生錯(cuò)配，從而使得溶解溫度發(fā)生改變。進(jìn)而根據(jù)AXIN2基因突變型設(shè)計(jì)特異性的肽核酸PNA探針以及引物對(duì)AXIN2突變型基因進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)一輪的PCR擴(kuò)增后，即可將AXIN2基因突變型與野生型進(jìn)行區(qū)分開(kāi)來(lái)。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

用于軸抑制蛋白(AXIN2)基因V765A突變檢測(cè)的試劑盒，它包括以下引物及探針：