[發明專利]質粒載體及其構建方法、應用

在審

• 申請號: 201711159062.7
• 申請日: 2017-11-20
• 公開（公告）號: CN107904252A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: 許澎;黃巧;湯賓
• 申請（專利權）人: 湖南豐暉生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C07K14/47
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 張柳,趙青朵

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及質粒載體及其構建方法、應用。

背景技術

顆粒溶素(granulysin，GNLY)是存在于人類細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlympocytes,CFLs)和自然殺傷細胞(NKCells)胞漿顆粒中的細胞毒性蛋白。目前認為顆粒溶素有9kDa和15kDa兩種形式。兩種不同的形式同樣都有生物學功能。但是市面是多數的載體構建都是表達其中的一種形式，或者是9kDa的，或者是15kDa的顆粒溶素蛋白。我們構建的雙表達質粒載體，可以同時表達兩種形式。將其轉染到細胞中以后，兩種蛋白都可以表達，并且表達量相當。氨基酸序列分析表明其與NK溶素和阿米巴溶素(抗微生物蛋白)同源，為脂結合蛋白一皂素樣蛋白(saposin-likeprotein,SAPLIP)家族的成員之一。GNLYmRNA主要在CTL和NK細胞活化后，3—5天增加，5—7天劇增，在機體免疫應答過程中。

顆粒溶素是一種溶細胞和促炎癥分子，表達于活化的人類細胞毒T細胞(CTLs)和自然殺傷(NK)細胞。目前認為顆粒溶素有9kDa和15kDa兩種形式，具有溶細胞性、溶腫瘤性、殺菌活性、趨化作用、促炎癥等功能。但是顆粒溶素對正常人細胞的毒性很低，所以在對抗耐藥性細菌方面具有廣闊的應用前景。

目前認為顆粒溶素有9kDa和15kDa兩種形式。9kDa顆粒溶素是15kDa顆粒溶素的前體。9kDa顆粒溶素通過鈣依賴通道途徑釋放到效應細胞與靶細胞之間。該顆粒溶素與其他皂素樣蛋白家族同源，通過與靶細胞表面結合引起離子流，從而對多種微生物和腫瘤起溶細胞作用。15kDa顆粒溶素是自然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T細胞(CTLs)通過非顆粒溶細胞途徑釋放到細胞外.其濃度在T細胞活化后升高。關于15kDa顆粒溶素溶細胞性說法不一，研究認為15kDa顆粒溶素有類似于9kDa顆粒溶素的溶細胞潛能。

現在廣泛報道的顆粒溶素的表達載體的構建，主要有以下幾個特點：(1)表達其一種形式：9kDa或者15kDa的。(2)使用的載體根據轉染的細胞不同，可以是質粒載體也可以是病毒載體。但是，迄今為止，還沒有同時將兩種形式的顆粒溶素同時放到一個表達載體上的。

現在常用的同時表達兩種蛋白的方式，是分別將帶有不同蛋白的質粒轉染到同一個細胞中，讓細胞表達兩種蛋白。這種方式的缺點是(1)不能確定細胞是否同時表達兩種載體。因為在轉染的過程中，不可避免的有一種細胞表達只表達其中的一種蛋白；(2)同一個細胞中兩種蛋白的表達量不一樣，一個多一個少，對后續的實驗的開展造成很大的麻煩。

于是，近年來，質粒的雙表達載體慢慢興起。比如美國invitrogen的pIRES載體就同時具有2個多克隆位點區，可以同時表達2個蛋白。這種質粒也存在一個問題就是：IRES序列后面的下游基因的表達不穩定。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種質粒載體及其構建方法、應用。本發明提供了雙表達載體是以此質粒載體為基礎，使用具有自我剪切功能的p2A序列代替到IRES(內部核糖體進入位點序列)。這樣在轉染后，質粒從CMV啟動子區域開始形成的mRNA可以自我剪切成2個獨立的mRNA序列，分別表達兩種基因，并且保證了兩種蛋白的表達量相當，方便后續的研究。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了具有自我剪切功能的2A元件在構建質粒載體中的應用。

在本發明的一些具體實施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件選自P2A、T2A或E2A。

在本發明的一些具體實施方案中，所述質粒載體含有兩個多克隆位點的所述具有自我剪切功能的2A元件。

在本發明的一些具體實施方案中，所述質粒載體還包括目的基因，所述目的基因為編碼9kDa顆粒溶素的基因和/或15kDa顆粒溶素的基因。

本發明還提供了一種質粒載體，包括含有兩個多克隆位點的具有自我剪切功能的2A元件以及目的基因。

在本發明的一些具體實施方案中，所述具有自我剪切功能的2A元件選自P2A、T2A或E2A。

在本發明的一些具體實施方案中，所述目的基因為編碼9kDa顆粒溶素的基因和/或15kDa顆粒溶素的基因。

本發明還提供了所述的質粒載體的構建方法，包括如下步驟：

步驟1：取pIRES-EGFP載體，經BamHI、BstXI雙酶切切除IRES，獲得線性化載體片段；合成帶有BamHI與BstXI酶切位點的P2A片段進行雙酶切，獲得P2A片段，與所述線性化載體連接，構建獲得p2A-EGFP載體；